真菌性角膜炎的病原菌鑒定和藥物敏感性分析

賀 丹，張曉威，2，郝繼龍，萬 雪，單秋實，王 麗＊

（1.吉林大學基礎醫學院 病原生物學系，吉林大學真菌研究中心，吉林 長春130021；2.長春市兒童醫院 檢驗科，吉林 長春130061；3.吉林大學第一臨床醫院 眼科，吉林 長春130021）

真菌性角膜炎是一種在世界范圍內廣泛流行的較頑固的真菌感染，常伴有化膿性感染、角膜潰瘍及視力受損，甚至可導致失明或者失去患眼，嚴重影響患者的健康和生活質量。近年來，由于植物性角膜外傷的增多，隱形眼鏡的使用不當，抗生素、激素的廣泛使用等原因，導致真菌性角膜炎的發病率明顯增高[1－5]。該病發病隱匿、進展迅速、不易診斷，且有效的眼部抗真菌藥數量較少、療效較差，致盲率較高，倍受真菌學研究者與眼科醫生的關注。因此，掌握真菌性角膜炎病原真菌種類、藥物敏感性等特點，了解發病易感因素、高發年齡、多發季節等流行病學規律，對于該病的早期診斷和有效治療具有重要的意義。

本研究收集了7年間就診于吉林大學附屬臨床醫院眼科，疑似真菌性角膜炎患者的角膜刮片標本及相關臨床資料，進行了病原菌鑒定、流行病學調查及藥物敏感性檢測，為臨床真菌性角膜炎的診治積累了有用的資料。

1 材料與方法

1.1 采集標本 角膜刮片標本采集自2004年10月至2012年9月，就診于吉林大學附屬臨床醫院眼科256例疑似真菌性角膜炎患者。

1.2 主要試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）、馬鈴薯葡萄糖液體培養基（PDB）購于美國Difco公司，科瑪嘉（CHROmagar）顯色培養基購于鄭州博賽生物技術研究所。伊曲康唑（ICZ）、兩性霉素B（AmB）、伏立康唑（VCZ）購于美國Sigma公司，納他霉素（NTC）購于德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.3 病原真菌分離、培養 將角膜刮片標本接種于2ml PDB培養基中，28℃、110rpm振蕩培養72h后，如見渾濁或菌絲生長，將其接種于PDA平板培養基28℃培養。逐日觀察菌落生長情況，記錄其形態特征。1個月后仍未見生長的標本結束培養。

1.4 病原真菌鑒定 對絲狀型菌落采用小瓊脂塊兒培養法、乳酸酚棉蘭染色，根據顯微鏡下觀察菌絲有無分隔、分生孢子形狀、大小、排列、顏色等特征進行鑒定。對酵母及類酵母型菌落采用革蘭染色，根據芽生孢子等形態特征做初步鑒定；進一步將其接種于科瑪嘉顯色培養基，35℃培養48h，根據菌落的形態、顏色等特征進行分型鑒定。

1.5 體外藥物敏感性檢測 選擇臨床感染較常見的茄病鐮刀菌（28株）、煙曲霉（12株）及光滑假絲酵母（10株）作為受試菌株。參考美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）的微量液基稀釋法，即酵母菌M27－A2方案和絲狀真菌M38－A方案，檢測受試菌株對 AmB、ICZ、VCZ及 NTC 的敏感性[6，7]。以克柔假絲酵母（Candida krusei，ATCC 6258）和近平滑假絲酵母（Candida paapsilosis，ATCC 22019）作為質控菌株。將菌株孢子懸液接種于藥敏板后35℃培養，假絲酵母生長24h、絲狀真菌生長48h后，判讀結果，4種藥物均以100% 受抑制作為最小抑菌濃度（MIC）判定終點。計算 MIC值、MIC范圍、算術平均值及幾何平均值。

1.6 流行病學分析 利用SPPS 13.0統計學分析軟件，對真菌性角膜炎患者的性別、年齡、季節、職業、誘發因素等信息及藥物敏感性進行分析。

2 結果

2.1 病原真菌鑒定結果

256例疑似真菌性角膜炎患者標本中，單一真菌感染者158例，真菌和細菌混合感染者12例，兩種真菌混合感染者12例，182例患者被診斷為真菌性角膜炎。真菌培養陽性率為71.1%，共分離、鑒定了16屬29種194株真菌菌株。病原菌以鐮刀菌屬為主（47.0%），其中茄病鐮刀菌最常見（32.0%，圖1）；其次為曲霉屬 （20.6%）和假絲酵母屬（14.4%）（圖2）。

2.2 流行病學調查結果

圖1 茄病鐮刀菌的形態學特征

圖2 194株分離真菌菌株的種屬分布情況

臨床檢查發現大部分患者具有眼痛、畏光、流淚、分泌物增多、角膜上皮缺損、有邊界不清的白色膏狀浸潤灶、球結膜充血、視力下降、化膿性感染、抗生素治療無效等典型的臨床癥狀。患者平均年齡為49.9±11.9 歲，其中41－60歲最易發生感染（59.3%）。男女比例為1.3∶1。以秋季發病率最高（39.0%）。農民居多，占81.3%。有角膜外傷史者占29.1%，曾使用抗生素、激素及抗真菌藥物治療史者占57.7%。

2.3 體外藥物敏感性檢測結果

質控菌株克柔假絲酵母和近平滑假絲酵母重復3次藥物敏感性試驗（以下簡稱藥敏試驗），MIC結果均在CLSI公布的標準范圍內，表明該藥敏試驗體系符合標準。利用該體系對50株茄病鐮刀菌、煙曲霉、光滑假絲酵母進行了ICZ、VCZ、AmB及NTC4種抗真菌藥的敏感性檢測（表1－3）。

目前，國際上尚未見公認絲狀真菌MIC范圍，有研究認為對AmB的MIC≥2μg／ml時可能存在耐藥現象；對NTC的MIC≤16μg／ml為敏感范圍；對ICZ的MIC＜1μg／ml為敏感，MIC≥1μg／ml為耐藥；VCZ的 MIC＜4μg／ml為敏感，而 MIC≥8 μg／ml為耐藥[8]。本研究結果表明，受試茄病鐮刀菌對NTC全部敏感，對ICZ均不敏感；其對AmB的MIC幾何平均值最低。受試煙曲霉和光滑假絲酵母對AmB僅分別有50%和80%敏感，對其他3種藥物均敏感；對ICZ的MIC幾何平均值最低。

采用Friedman Test分別對3種主要病原真菌進行4種不同抗真菌藥的多個配對樣本的秩和檢驗（＞16者按32處理），結果顯示4種抗真菌藥之間差異有統計學意義（均為P＜0.05）。利用Kruskal Wallis Test分別對4種藥物進行3種不同病原菌之間的多個獨立樣本的秩和檢驗，結果顯示對于AmB差異無統計學意義（P＞0.05），而對ICZ、VCZ及 NTC，3種病原菌之間的差異有統計學意義（均為P＜0.05）。表明NTC對茄病鐮刀菌抑制效果最佳，而ICZ對煙曲霉和光滑假絲酵母抑制效果最佳。

表1 28株茄病鐮刀菌的 MICs（μg／mL）

表2 12株煙曲霉的 MICs（μg／mL）

表3 10株光滑假絲酵母的MICs（μg／mL）

3 討論

菌性角膜炎的病原菌多達56屬105種[4，9]。由于氣候、環境及地理條件等多種因素的影響，導致真菌性角膜炎的發病率及其病原菌譜，在各個國家和地區間存在差異[4，5，10－13]。因此，掌握真菌性角膜炎的病原學特點及流行病學規律，有利于更好的制定預防、診斷及治療策略，滿足眼科醫生和患者的需求。本研究結果表明，吉林省真菌性角膜炎病原菌以鐮刀菌為主，其中茄病鐮刀菌最常見，與我國其他地區調查結果一致[2，14，15]。美國的Tanure等[13]研究發現該病病原菌中，白假絲酵母超過鐮刀菌約占46%，印度的Sengupta等[16]研究發現19%的感染是由白假絲酵母引起的假絲酵母性角膜炎。而本研究發現光滑假絲酵母引起的感染較多見，考慮可能與患者早期預防性或治療性使用抗真菌藥物有關，導致耐藥性較高的光滑假絲酵母等非白假絲酵母的分離率增高。

由于吉林省是我國糧食的主要產區，從事農作人口較多。本研究調查結果顯示80%以上的患者是農民，41－60歲中老年和男性發病較多，部分患者有植物或異物外傷史，以秋季農忙時節發病較多，提示在農村從事勞作時應注意防止發生角膜外傷，以減少真菌感染的發生。此外，研究還發現近60%的患者有不合理用藥史，提示一旦出現感染癥狀應及早到醫院就診，臨床醫生應結合外傷史可慮真菌感染的可能，根據實驗室檢查結果給予合理的藥物治療。

藥物敏感性檢查結果表明，3種主要病原真菌對NTC均敏感，煙曲霉和光滑假絲酵母對ICZ敏感，但茄病鐮刀菌對ICZ耐藥。提示臨床上確診為茄病鐮刀菌感染可選擇NTC治療，而其它兩種病原菌感染可選擇ICZ治療。如根據患者典型癥狀高度懷疑是真菌感染時，在未獲得實驗室準確診斷前可首先選擇NTC滴眼液，進行預防性局部抗真菌治療，有利于控制病情的發展，對于改善預后具有重要意義。

[1]He D，Hao J，Zhang B，et al.Pathogenic spectrum of fungal keratitis and specific identification of Fusarium solani[J].Invest Ophth Vis Sci，2011，52（5）：2804.

[2]Sun XG，Zhang Y，Li R，et al.Etiological analysis on ocular fungal infection in the period of 1989－2000[J].Chin Med J（Engl），2004，117（4）：598.

[3]Shukla PK，Kumar M，Keshava GB.Mycotic keratitis：an overview of diagnosis and therapy[J].Mycoses，2008，51（3）：183.

[4]Thomas PA.Fungal infections of the cornea[J].Eye （Lond），2003，17（8）：852.

[5]Sirikul T，Prabriputaloong T，Smathivat A，et al.Predisposing factors and etiologic diagnosis of ulcerative keratitis[J].Cornea，2008，27（3）：283.

[6]Espinel－Ingroff A，Barchiesi F，Cuenca－Estrella M，et al.International and multicenter comparison of EUCAST and CLSI M27－A2 broth microdilution methods for testing susceptibilities of Candida spp.to fluconazole，itraconazole，posaconazole，and voriconazole[J].J Clin Microbiol，2005，43（8）：3884.

[7]Espinel－Ingroff A，Fothergill A，Ghannoum M，et al.Quality control and reference guidelines for CLSI broth microdilution susceptibility method（M 38－A document）for amphotericin B，itraconazole，posaconazole，and voriconazole[J].J Clin Microbiol，2005，43（10）：5243.

[8]Sheehan DJ，Hitchcock CA，Sibley CM.Current and emerging azole antifungal agents[J].Clin Microbiol Rev，1999，12（1）：40.

[9]Kalkanci A，Ozdek S.Ocular fungal infections[J].Curr Eye Res，2011，36（3）：179.

[10]Chowdhary A，Singh K.Spectrum of fungal keratitis in North India[J].Cornea，2005，24（1）：8.

[11]Hofling－Lima AL，Forseto A，Duprat JP，et al.Laboratory study of the mycotic infectious eye diseases and factors associated with keratitis[J].Arq Bras Oftalmol，2005，68（1）：21.

[12]Tuft SJ，Tullo AB.Fungal keratitis in the United Kingdom 2003－2005[J].Eye（Lond），2009，23（6）：1308.

[13]Tanure MA，Cohen EJ，Sudesh S，et al.Spectrum of fungal keratitis at Wills Eye Hospital，Philadelphia，Pennsylvania[J].Cornea，2000，19（3）：307.

[14]Xuguang S，Zhixin W，Zhiqun W，et al.Ocular fungal isolates and antifungal susceptibility in northern China[J].Am J Ophthalmol，2007，143（1）：131.

[15]王麗婭，王剛生.中國三地區真菌性角膜病致病菌種的調查[J].中華眼科雜志，2000，36（2）：138.

[16]Sengupta J，Khetan A，Saha S，et al.Candida keratitis：emerging problem in India[J].Cornea，2012，31（4）：371.