PCR－熒光探針法檢測分枝桿菌的臨床應(yīng)用價值

梁雪妮，盛翔宇，孫炳奇，薛文成，孟冬婭＊

（1.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 檢驗科，遼寧 沈陽110016；2.沈陽市胸科醫(yī)院 檢驗科，遼寧 沈陽110044）

結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis MTB）和非結(jié)核分枝桿菌（non－tuberculous mycobacterium NTM）感染引起的結(jié)核病和NTM感染是一種傳染力強、發(fā)病率高的慢性病，近年來NTM感染呈上升趨勢，已引起國內(nèi)外的關(guān)注[1，2]。臨床上常用的抗酸染色法不能分辨出MTB和NTM；傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法雖準(zhǔn)確，但培養(yǎng)周期長、費時、復(fù)雜[3，4]，不能為患者早期診斷和治療提供依據(jù)。因此，正確、快速鑒定分枝桿菌對臨床有重要的指導(dǎo)作用[5]。本文采用博奧生物有限公司研制的晶芯○R分枝桿菌核酸檢測試劑盒（PCR－熒光探針法），對改良羅氏培養(yǎng)陽性的69份標(biāo)本核酸進(jìn)行檢測，并將結(jié)果與羅氏培養(yǎng)進(jìn)行對比，探討兩種方法臨床應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象

研究對象為2011年9月－2013年3月在沈陽軍區(qū)總醫(yī)院和沈陽市胸科醫(yī)院門診和住院送檢的標(biāo)本，標(biāo)本類型包括痰液、胸腹水、腦脊液。本研究從中選取69例改良羅氏培養(yǎng)陽性的標(biāo)本進(jìn)行實驗。

1.2 主要試劑和儀器

改良羅氏培養(yǎng)基、對硝基苯甲酸（PNB）和噻吩－2－羧酸肼（TCH）試劑為天津市金章科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品，PCR－熒光探針檢測試劑為北京博奧生物有限公司晶芯○R分枝桿菌核酸檢測試劑盒。所用儀器有培養(yǎng)箱，微量離心機，Roche公司LightCycler○R480PCR儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 改良羅氏培養(yǎng)和菌種鑒定試驗 改良羅氏培養(yǎng)和分枝桿菌菌種鑒定（PNB和TCH試驗）均嚴(yán)格按《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[6]和試劑說明書進(jìn)行。

1.3.2 PCR－熒光探針檢測 嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行，主要實驗操作包括樣本處理、DNA提取、擴(kuò)增試劑和陰陽性試劑準(zhǔn)備、加樣和PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：20μl（PCR擴(kuò)增反應(yīng)液18μl、模板 DNA 2μl）。擴(kuò)增程序：37℃5min，1個循環(huán)；94℃3min，1個循環(huán)；94℃15s，60℃30s，40循環(huán)；50℃10s，1個循環(huán)。檢測通道設(shè)定：同時選擇FAM（465－510nm）和 HEX（540－580nm）通道，熒光采集點選擇60℃30s。

1.3.3 測序 對于PCR－熒光探針法和改良羅氏培養(yǎng)法檢測結(jié)果不一致的標(biāo)本，將標(biāo)本核酸交給北京博奧生物有限公司進(jìn)行DNA序列測定，并以測序結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 改良羅氏培養(yǎng)法檢測結(jié)果

挑取羅氏培養(yǎng)基上單個菌落進(jìn)行PNB和TCH試驗，當(dāng)PNB（－）、TCH（＋）時，判為 MTB；當(dāng)PNB（＋）、TCH（＋）時，判為NTM。改良羅氏培養(yǎng)法聯(lián)合PNB、TCH試驗將69例標(biāo)本中的16例鑒定為MTB，53例鑒定為NTM。

2.2 PCR－熒光探針法檢測結(jié)果

參照PCR－熒光探針法的判讀標(biāo)準(zhǔn)（表1），在69例標(biāo)本中，19例鑒定為MTB，50例鑒定為NTM。

2.3 改良羅氏培養(yǎng)法和PCR－熒光探針法檢測結(jié)果比較

對69例標(biāo)本，兩種方法檢測的一致率比較見表2，由表2見，改良羅氏培養(yǎng)法和PCR－熒光探針法檢測的 總 一致率為 89.9% （62／69）；MTB 一 致 率87.5%（14／16）；NTM 一致率90.6%（48／53）。兩種方法檢測結(jié)果不一致的共7例。

2.4 測序法檢測結(jié)果

采用測序的方法對兩種方法檢測不一致的7例進(jìn)行驗證，測序結(jié)果與實驗方法的結(jié)果比較見表3。與測序結(jié)果比對后，改良羅氏培養(yǎng)法檢測的正確率為94.2%，PCR－熒光探針法檢測的正確率為92.8%。

表1 PCR－熒光探針法檢測結(jié)果及解釋

表2 改良羅氏培養(yǎng)法與PCR－熒光探針法檢測結(jié)果一致性比較

表3 7例測序結(jié)果與實驗方法的結(jié)果比較

3 討論

本實驗對69例改良羅氏培養(yǎng)陽性標(biāo)本進(jìn)行PCR－熒光探針法檢測，改良羅氏培養(yǎng)將其中16例鑒定為MTB，53例鑒定為NTM。PCR－熒光探針法將其中19例鑒定為 MTB，50例鑒定為NTM。對兩種檢測方法的一致性進(jìn)行分析，兩種方法MTB檢測一致率為87.5%，NTM 檢測一致率為90.6%，總一致率為89.9%。有7例改良羅氏培養(yǎng)法檢測的結(jié)果和PCR－熒光探針法檢測的結(jié)果不符，我們進(jìn)行了測序驗證。

2138、2134號標(biāo)本測序結(jié)果為NTM，改良羅氏培養(yǎng)法的結(jié)果為MTB。羅氏培養(yǎng)和測序不一致的原因可能是在進(jìn)行PNB和TCH試驗時，菌量加入不夠、菌不夠純或是判讀時陽性不明顯，人主觀認(rèn)為PNB（－）、TCH（＋）而判定為 MTB。

2212、1703、2852號標(biāo)本的測序結(jié)果為NTM，PCR－熒光探針法檢測的結(jié)果為 MTB。PCR－熒光探針法對FAM通道很敏感，只要FAM通道（＋），就會判為MTB，但在FAM通道和HEX通道同時為（＋）時，可能存在 MTB和NTM的混合感染。這3份標(biāo)本的FAM和HEX通道均為（＋），疑似混合感染，但這3個標(biāo)本的測序結(jié)果NTM，說明PCR－熒光探針法檢測結(jié)果存在假陽性，造成PCR擴(kuò)增假陽性的原因很多，模板DNA提取不純或是操作過程中存在污染是常見的原因。

1170、1981號標(biāo)本測序結(jié)果為 MTB和NTM混合，改良羅氏培養(yǎng)法的檢測結(jié)果為NTM，PCR－熒光探針法檢測結(jié)果為MTB，。這2份標(biāo)本改良羅氏培養(yǎng)未檢測出MTB，我們分析可能有3方面原因（1）在培養(yǎng)過程中，NTM 生長的快，MTB生長的慢，或者兩者生長的菌落數(shù)多少不等，因此在做PNB和TCH鑒別試驗時，生長快的或是菌落數(shù)多的，PNB和TCH試驗陽性結(jié)果就明顯些；（2）在做PNB和TCH試驗時，出現(xiàn)了TCH（＋），就報告了MTB，此時PNB可能是（＋），只是出現(xiàn)的較晚；（3）我們只做一對PNB和TCH試驗，結(jié)果同為陽性判為NTM，PNB（－）、TCH（＋）判為 MTB，若為混合感染，NTM的PNB和TCH陽性結(jié)果就會干擾MTB的判讀；這3種情況可能使改良羅氏培養(yǎng)只鑒別出NTM。PCR－熒光探針法只要FAM通道有熒光信號就判為MTB，1170、1981號標(biāo)本的FAM通道和HEX通道均有熒光信號，二者可能為混合感染。對混合感染，PCR－熒光探針法只檢測出MTB，未檢測出NTM，這對臨床也是有著重要的指導(dǎo)作用，因為混合感染時應(yīng)先治療MTB。

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