miRNA－21在結直腸癌中的表達研究

邱 實，孟凡旭，劉 念，劉林林

（吉林大學第二醫院 放療科，吉林 長春130041）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是胃腸道中常見的惡性腫瘤，隨著近些年我國人口老齡化加劇、飲食習慣和生活方式的改變，結直腸癌的發病率和死亡率較前明顯上升[1]。結直腸癌的早期篩查與診斷越來越受人們的關注。microRNA（miRNA）是由Lee等于1993年發現的一類新的長度為19－25的內源性非編碼RNA分子，參與了發育、細胞增殖、分化及凋亡等一系列重要生命過程。近些年研究發現，在腫瘤發生發展過程中miRNA發揮類似抑癌基因和癌基因的作用，影響腫瘤的發生、發展[2]。本次研究應用實時定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測miRNA－21在正常人和結直腸癌患者血清，以及結直腸癌患者癌組織和癌旁組織中的表達，分析miRNA－21表達水平與結直腸癌臨床病理參數的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2012年5月——2012年8月于吉大三院行手術治療的42例經病理診斷為結直腸癌的患者為研究對象，術前未行放化療。患者年齡52歲－74歲，中位年齡62歲，男26例，女16例，按照美國癌癥聯合委員會（AJCC）／國際抗癌聯盟（UICC）結直腸癌TNM分期系統（2010年第七版）進行TNM分期。取腫瘤組織及癌旁組織（取材部位距離腫瘤邊緣至少5cm的正常腸黏膜組織），離體10min內放入液氮保存；抽取患者術前及術后血液，保存于超低溫冰箱。抽取同期16例健康人血液，年齡49歲－76歲，中位年齡61歲，其中男10例，女6例。

1.2 試劑及儀器

Trizol試劑（Takara公司）、DEPC 水（Takara公司）、miRNA isolation提取分離試劑盒（Takara公司）、MMLV Reverse Transcriptase（Takara公司）、Hairpin－itTM miRNAs RT－PCR Quantitation Kit試劑盒（蘇州吉瑪基因股份有限公司）、引物hsmiRNA－21及內參U6均購自蘇州吉瑪基因股份有限公司；ABI－7300實時熒光定量儀（美國ABI公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 RNA提取 取3－5ml血液樣本加入紅細胞裂解液至10ml，3 000r／min離心10min，棄上清，沉淀中加入1ml Trizol，按照miRNA isolationg提取分離試劑盒說明書中的步驟提取miRNA。

取液氮保存組織樣本約500mg，研磨后加入1 ml Trizol，然后按照miRNA isolationg提取分離試劑盒說明書中的步驟提取miRNA。

使用紫外分光光度儀測定提取RNA的濃度及純度，其 A260／A280比值應在1.8－2.1之間，計算RNA濃度用于進一步實驗。

1.3.2 RNA的逆轉錄 取3μg模版RNA，加入4 μl 5×MMLV RT Buffer、0.75μl dNTP（10mM）、1.20μl MiR－RT primers（1μM）、0.25μl Rnasin（40U／μl）及0.2μl MMLV Reverse Transcriptase（200U／μl），RNase－free water將總體系補至20μl構成逆轉錄反應體系。使用普通PCR儀將提取的總RNA逆轉錄成cDNA。反應條件：25℃30min，42℃30min，85℃5min。

1.3.3 RT－qPCR 血清樣本和組織樣本逆轉錄得到的cDNA 為模版，按照 Hairpin－itTMmiRNAs RT－PCR Quantitation Kit試劑盒說明書加入相關試劑及引物，以U6為內參，在ABI－7300實時熒光定量儀上進行PCR擴增。反應條件：95℃3min預熱，然后95℃12s、62℃40s共40個循環。

1.4 數據分析

本試驗采用2－ΔΔCt法進行表達量分析。反應體系中熒光信號達到閾值的循環數為Ct，ΔΔCt＝（Ct實驗組目的基因－ Ct實驗組管家基因）－ （Ct對照組目的基因－Ct對照組管家基因），計算ΔΔCt后再計算2－ΔΔCt值，2－ΔΔCt為miRNA的相對表達比率。

使用SPSS 12.0統計軟件，計算資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，P≤0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

miRNA－21在結直腸癌患者血清（3.64±0.31）中表達明顯高于正常人血清（1.02±0.12）（P＜0.05），miRNA－21在結直腸癌組織（7.17±1.46）中表達水平明顯高于癌旁組織（2.33±0.84）（P＜0.05），中晚期（Ⅲ期和Ⅳ期）結直腸癌組織（7.25±0.76）中表達水平明顯高于早期（Ⅰ期和Ⅱ期）結直腸癌（3.25±0.24）（P＜0.05）；低分化腫瘤組織（7.18±1.08）中miRNA－21表達水平明顯高于中高分化者（3.31±0.68）；有淋巴結轉移的結直腸癌組織（7.16±1.14）中miRNA－21表達水平明顯高于無淋巴結轉移者（3.47±0.84）（見表1）。且發現結直腸癌患者血清中 miRNA－21的表達與癌組織中的miRMA－21表達間存在秩相關關系（見圖1）。

表1 miRNA－21表達水平與結直腸癌臨床病理參數的關系

3 討論

圖1 miRNA－21在結直腸癌患者血清中與癌組織中相對表達率關系

大量研究表明，miRNA參與胚胎發育、細胞周期調控、細胞分化增殖與凋亡等重要的生命進程[3]。隨著分子生物學技術的不斷發展及研究的深入，對miRNA的認識也越來越深刻。其通過識別結合靶mRNA從而影響靶mRNA的降解或翻譯來調節靶基因的表達[4]。生物信息學分析發現，盡管miRNAs僅構成人類基因組的1%－3%，但多達30% 的人類基因可能被miRNAs所調節[5]。有50%以上的miRNA基因位于腫瘤相關基因組區域內，多種miRNA在人類腫瘤中都存在異常表達，如結直腸癌中 miRNA－145表達下調[6]、胰腺癌中 miRNA－21表達上調[7]、胃癌中的 miRNA－155 表達上調[8]等。提示miRNA可能發揮類似癌基因及抑癌基因的作用，在腫瘤的發生發展過程中發揮著重要作用[9]。miRNA－21是在人類組織中發現較早、研究比較多的miRNA，現已發現在胃癌、胰腺癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤組織中存在明顯的上調，因此認為其在腫瘤發生過程中發揮類癌基因作用。目前已證實miRNA通過作用于 P53、Bcl－2、PTEN 等靶基因，參與腫瘤生長、轉移，與腫瘤侵襲及耐藥等密切相關[10－12]。

本次研究采用RT－qPCR技術檢測了正常人和結直腸癌患者血清，以及結直腸癌患者癌組織和癌旁組織中的表達，結果顯示結直腸癌患者miRNA－21表達水平與性別、年齡無明顯相關性，結直腸癌患者血清中miRNA－21表達水平顯著高于正常人血清（P＜0.05）；結直腸癌組織中 miRNA－21表達水平明顯高于癌旁組織；而且miRNA－21的表達與TNM分期有關，TNM分期越晚，其表達水平越高，在淋巴結轉移陽性的結直腸癌中表達明顯增高，其表達水平還與分化程度相關，低分化腫瘤組織中miRNA－21表達水平明顯高于中高分化者。同時還發現結直腸癌患者血清中miRNA－21的表達與癌組織中的miRMA－21表達間存在秩相關關系，但未能觀察到結直腸癌血清與癌組織中miRNA－21的相對定量之間的線性相關關系，這可能與樣本量較小有關，有待于更大樣本的研究。

本實驗入組的42例患者均行CEA及CA－199檢測，大部分在正常范圍內，僅有4例明顯高于正常范圍，但其血清miRNA－21的相對定量明顯高于正常人的平均值。且在本實驗中我們觀察到結直腸癌血清與癌組織中miRNA－21的相對定量之間的相關性，這使得miRNA－21i的血液檢測成為可能。但血清miRNA－21的檢測是否比傳統的腫瘤標記物具有更高的靈敏性及特異性，有待進一步大樣本的臨床研究。

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