人類激肽釋放酶基因6在卵巢惡性腫瘤中的表達及其機制研究

成志強，王 洋，王曉玫，曾照成，賀黎升，許 靜，金紅濤

（深圳市人民醫院 病理科，廣東 深圳518020）

人類組織激肽釋放酶基因（kallikrein gene，KLK）家族是由位于19號染色體q13.4區域的300 kb基因序列組成，包含15個人類組織 KLK[1－3]。研究顯示：KLK家族中部分基因與人類多種疾病的發生、發展，尤其是在多種惡性腫瘤中密切相關[4－7]。作為婦科常見的惡性腫瘤，卵巢癌的發病率位列女性生殖道惡性腫瘤第三位，其發病率在我國約為女性生殖道惡性腫瘤的22.9%[8]。本研究通過RTPCR的方法檢測KLK6的mRNA表達；用免疫組織化學方法檢測KLK6蛋白在卵巢腫瘤中的表達情況，初步探討其KLK6在卵巢癌發生，發展的作用機制，為進一步研究提供理論依據。

1 材料方法

1.1 臨床資料 收集自2008年2月至2012年1月，于深圳市人民醫院婦產科手術切除的新鮮卵巢癌組織標本30例，交界性腫瘤10例，良性卵巢腫瘤12例（漿液性囊腺瘤8例＋漿液性囊腺瘤4例），以及同期因子宮肌瘤手術切除的正常卵巢組織（經病理證實）新鮮標本15例。將上述組織中部分放入液氮凍存用于RNA提取；部分用福爾馬林固定用于免疫組化檢測。同時收集深圳市人民醫院病理科2008年2月至2012年1月期間的手術存檔蠟塊65例，其中乳頭狀囊腺瘤占18例（漿液性10例，黏液性8例），交界性卵巢腫瘤占15例（漿液性9例，黏液性6例），卵巢癌32例。所有卵巢癌組織標本的患者年齡約在22－73歲，≤50歲42例，＞50歲20例；漿液性癌38例，黏液性癌12例，其他12例，按FIGO分期：Ⅰ－Ⅱ期19例，Ⅲ－Ⅳ期43例。組織學分級[9]：G1級11例，G2級27例，G3級24例；淋巴結無轉移19例，淋巴結有轉移43例。卵巢癌患者均為初發，術前未接受任何過放、化療及免疫治療。所有標本均再次做HE染色，由高年資病理醫師復核。

1.2 方法

1.2.1 RT－PCR 取新鮮標本組織約2g，先用Trizol RNA提取試劑盒（Invitrogen公司）提取總RNA，再以分光光度儀測定RNA的濃度，加以校正統一，后放置于－80℃備用。RT－PCR試劑盒購自TaKaRa公司（大連寶生物），嚴格參照試劑盒說明書上的實驗步驟進行操作。KLK6引物序列上游：5’－ATT TCC CTG ACA CCA TCC AG－3’；下游：5’－GGG ATG TTA CCC CAT GAC AC－3’。內參使用β－actin，上游：5’－CAG CCA TGT ACG TTG CTA TCC AGG－3’；下游：5’－AGG TCC AGA CGC AGG ATG GCA TG－3’。PCR反應條件：94℃預變性5min；94℃變性30sec，63℃退火25sec，72℃延伸30sec，共40個循環；最后72℃延伸5min。將增產物置于20g／L瓊脂糖凝膠進行電泳。通過KLK6與β－actin條帶灰度值的比值來反映KLK6mRNA相對表達量。

1.2.2 免疫組織化學 將新鮮的標本置于石蠟進行包埋切片（厚4μm）。采用免疫組化SP法檢測，嚴格參照試劑盒說明書進行操作。一抗工作濃度為1∶100，用PBS作為陰性對照，用已知KLK6蛋白陽性表達的胃癌組織切片為陽性對照。參考以往的文獻[10]制訂判讀的標準：以棕色顆粒出現在胞質的細胞作為KLK6陽性細胞。根據細胞染色的強度進行計分：細胞無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分；還要在高倍鏡下隨機選取5個視野，每個視野內計數100個細胞，計算陽性細胞占總細胞數的百分比，陽性細胞百分比為0%計0分，＜10%計1分，10%－50%計2分，51%－80%計3分，＞80%計4分。認定兩項評分之和≥4分為陽性表達。

1.2.3 統計學處理 采用SPSS17.0進行統計分析，正常卵巢組織與卵巢癌組織中KLK6的mRNA表達水平的比較采用t檢驗（經正態性檢驗和方差齊性檢驗）的方法，卵巢癌中KLK6蛋白的表達與臨床病理特征關系的比較采用χ2檢驗，檢驗水準α＝0.05。

2 結果

2.1 不同卵巢組織中KLK6mRNA的表達（圖1）

KLK6在卵巢癌、交界性腫瘤、良性卵巢腫瘤及正常卵巢組織均有不同程度的表達，但在卵巢癌及交界性腫瘤中，KLK6的mRNA表達水平明顯高于正常卵巢組織，具有顯著差異 （P＜0.01）。

圖1 KLK6mRNA在卵巢癌中的表達差異

2.2 不同卵巢組織中KLK6蛋白的表達（圖2）

在正常卵巢組織中KLK6蛋白的陽性表達率為13.3%（2／15），在乳頭狀囊腺瘤組織中KLK6蛋白的陽性表達率為16.7%（5／30），在交界性卵巢腫瘤組織中KLK6蛋白的陽性表達率為44.0%（11／25），在卵巢癌組織中KLK6蛋白的陽性表達率為69.4%（43／62），差異有統計學意義（χ2＝25.843，P＜0.001）。

2.3 卵巢癌患者的KLK6蛋白表達與臨床病理特征的關系（表1）

表1 KLK6蛋白表達與臨床病理特征的關系

圖2 不同卵巢組織KLK6蛋白的表達情況（SP法，×400）

3 討論

人類組織KLK基因家族是編碼絲氨酸蛋白酶的一組同源基因家族，串聯排列在19q13.4染色體上，包括 KLKl、KLK2、KLK3（前列腺特異抗原PSA）3種“經典KLK”和新近發現的12種KLK基因（KLK4－KLKl5）。KLKs編碼的蛋白酶（hKs）可能參與血管張力與通透性的維持、各種生長因子的裂解激活、調節神經系統可塑性以及皮膚表皮細胞脫落與再生等眾多生理過程[11]。

KLK6基因是新近發現的KLK家族成員，編碼hK6蛋囟，同時由3個研究小組獨立克隆并被以不同名字命名：Anisowicz等[12]從乳腺癌細胞株中克隆出 KLK6cDNA命名為蛋白酶 M（ProteaseM），發現KLK6mRNA在某些乳腺癌細胞株和卵巢癌組織及細胞株中高表達；Yamashiro等[13]從大腸癌細胞株COLO201cDNA文庫中克隆出相同基因，命名為neurosin，其在腦組織中高表達；Little等[14]從 Alzheimer＇s病人腦組織中克隆出該基因，命名為zyme，認為KLK6在Alzheimer＇s病的發生發展中有重要作用。

Magklara等[15]研究認為KLKs編碼的hK6蛋白在體外可降解細胞外基質的主要成分纖維蛋白原和I型膠原以及基底膜的主要成分IV型膠原。但hK6誘導的ECM降解和腫瘤細胞生物學行為的關系及通過基因敲除等手段探討KLK6和腫瘤細胞侵襲轉移關系尚無研究報道。受類固醇激素的調控是KLKs的一個重要特點，研究證實雄激素上調KLK2和KLK3基因，而KLK6基因則對雌激素更敏感[16]。

綜上所述，本文對卵巢腫瘤中KLK6的表達進行檢測，結果顯示，在卵巢癌、交界性腫瘤組織中KLK6的mRNA水平和蛋白水平明顯高于良性腫瘤和正常卵巢組織，這一結果提示KLK6基因在卵巢惡性及低度惡性腫瘤的發生、發展中起到了重要的作用。結合該基因在細胞中的定位，我們認為：KLK6可能是通過調控其下游靶基因的啟動或進行轉錄后修飾調節來參與惡性腫瘤的發生，發展的過程。本研究同樣發現臨床分期越晚、組織分化越差同時伴有淋巴結轉移的卵巢惡性腫瘤組織中KLK6蛋白陽性表達率就越高，提示KLK6可能參與了卵巢惡性腫瘤的侵襲和轉移。這也使其有可能成為卵巢惡性腫瘤預后不良的檢測指標，為卵巢惡性腫瘤的復發和遠處轉移的機制研究提供了新思路。

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