內皮型一氧化氮合酶基因多態性與高血壓病發病相關性的研究

劉永生，韓洪波

（解放軍第208醫院1.心內科；2.內分泌科，吉林 長春130062）

原發性高血壓（EH）是隨著近年人口老齡化及人們生活水平提高而發病率大為提高的疾病之一。其引發的殘疾和病死都是較大的問題，且其病因不詳，因而沒有確且的對因治療措施，患者中絕大部分需要終生服藥治療，是一種難治的慢性疾病。當今世界范圍內已公認其為“無聲健康殺手”。眾所周知長期高血壓的患者易患多種心腦血管疾病，嚴重影響心、腦、腎等人體重要臟器結構與功能，如果高血壓病患者的血壓控制未能達到正常血壓指標，最終可導致這些臟器的功能衰竭[1]。基于如上情況，在基因水平探討高血壓病的發病相關因素已成為必然。已有諸多研究證實血NO水平與高血壓患者的血壓水平等因素存在某種相關關系，因而NO的代謝在高血壓病的病因研究中是值得加以深入研究的。而NO合成的限速酶基因也就自然被列入高血壓病的病因相關候選基因。本實驗就是著重研究內皮型NO合成酶（eNOS）基因多態性與高血壓發病相關性的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

高血壓病組：2009年10月至2011年10月就診于解放軍208醫院心內科門診的初診高血壓病患者，做各項相關輔助檢查排除繼發性高血壓、糖尿病、重度貧血、甲狀腺功能亢進、泌尿系感染、腎炎、高血鉀、嚴重心腎功能不全，經評估很高危高血壓病患者不納入實驗，兒童、妊娠婦女以及近期有腦出血、腦梗塞患者也為本實驗的排除對象。如上實驗對象共計215例，均自愿加入本實驗研究。其中男114例，女101例。年齡54.37±13.15歲。

對照組：同期就診于我院體檢中心參加體檢的中老年人，經各項檢查排除高血壓病及糖尿病，自愿參與本實驗，共計108例，男55例，女53例。年齡55.13±12.98歲。此組與實驗組間男女比例及年齡均經統計學檢驗示兩組間無明顯差異。全部實驗對象均為漢族，且相互間無血緣關系。

1.2 模板DNA的制備 所有實驗對象均采集空腹肘靜脈血4ml，用EDTA－K2抗凝，采用已建立的碘化鈉裂解、氯仿及戊醇提取法[2]提取白細胞基因組DNA，－30℃保存備用。

1.3 引物合成 所有引物均由上海生物工程有限公司合成 ① 應用Printer引物設計軟件設計一對引物，用于擴增eNOS啟動子區的一段DNA序列。上游引物：5′－ATGCTCCCACCAGGGCATCA－3′，下游引物：5′－GTCCTTGAGTCTGACATTAGGG－3′。②同樣應用Printer引物設計軟件設計一對引物，用于擴增eNOS第七外顯子區的一段DNA序列。 上游引物：5′－AAGGCAGGAGACAGTGGATG－3′，下游引物：5′－CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCT－3′。

1.4 擴增條件 ①eNOS基因啟動子－786區：擴增條件PCR反應體系為30μl，其中含有已提取模板DNA100ng，10×PCR緩沖液3.0μl，Taq酶（上海生工生物工程有限公司產品）2.0U，15mmol／L三磷酸脫氧核糖核苷 （dNTPs）0.5μl，上、下游引物各1μl。PCR反應條件為：97℃預變性5min，然后94℃45s，55℃50s，72℃50s，30個循環后，72℃延伸10min。4℃保存。以上所用主要儀器為Primus25型PCR儀。②eNOS基因第七外顯子第894位點上下游區：擴增條件PCR反應體系為50μl，其中含有已提取模板DNA100ng，10×PCR緩沖液4 μl，Taq酶 （上海生工生物工程有限公司產品）2.0U，15mmol／L三磷酸脫氧核糖核苷 （dNTPs）0.5μl，上、下游引物各1μl。PCR反應條件為：97℃預變性5min，然后94℃30s，65℃50s，72℃60 s，30個循環后，72℃延伸10min。4℃保存。以上所用主要儀器為Primus25型PCR儀。

1.5 擴增產物的限制性酶切及電泳 ①eNOS基因啟動子－786區：取 PCR擴增產物10μl，用10UNgOAIV酶（Prpmega Corporation公司）于37℃酶切16h。反應終止后，產物經3%瓊脂糖凝膠100V 電泳1.0h，銀鹽染色，染色后以DL100DNA片段長度標準物為參照物，在紫外燈下判斷結果，并拍照。②eNOS基因第七外顯子第894位點上下游區：取PCR擴增產物10μl，用BanⅡ8U（Prpmega Corporation公司）于37℃酶切10h。反應終止后，產物經3%瓊脂糖凝膠100V電泳1.0 h，EB染色，染色后以DL200DNA片段長度標準物為參照物，在紫外燈下判斷結果，并拍照。

1.6 統計學處理 用基因直接計數法計算兩組人群的基因型及等位基因頻率，不同人群間基因型及等位基因頻率用χ2檢驗，以P＜0.05為具有顯著性差異。其他諸如OR及95%CI均在SPSS13.0軟件包上完成。

2 結果

2.1 eNOS基因啟動子－786區基因型分析 PCR擴增產物大小為236bp，此研究位點的T／C突變可導致限制性內切酶NgOAIV的酶切位點產生，根據酶切狀況分析基因型有3種，TT型為正常純合子（236bp，1條帶），TC型為突變雜合子（236，203，33 bp，共3條帶），CC為突變純合子 （203，33bp，共2條帶），據條帶數目可以判斷基因型。

2.2 eNOS基因第七外顯子第894位點上下游區基因型分析 PCR擴增產物大小為248bp，此研究位點的G／T突變可導致限制性內切酶BanⅡ的酶切位點消失，根據酶切狀況分析基因型有3種，GG型為正常純合子 （163，85bp，共2條帶），GT型為突變雜合子（248，163，85bp，共3條帶），TT為突變純合子 （248bp，1條帶），據條帶數目可以判斷基因型。

2.3 兩組人群eNOS基因啟動子－786位點T／C多態性比較 如上多態性分布在高血壓病組與正常健康中老年人組的分布頻率有顯著差異性 （P＜0.05），見表1。

表1 兩組人群eNOS基因啟動子－786位點T／C攜帶頻率分布〔n（%）〕

2.4 兩組人群eNOS基因第七外顯子894位點G／T多態性比較 如上多態性分布在高血壓病組與正常健康中老年人組的分布頻率差異有顯著性 （P＜0.05），見表2。

表2 兩組人群eNOS基因第七外顯子894位點G／T攜帶頻率分布〔n（%）〕

2.5 兩組人群間eNOS基因啟動子－786位點T／C及第七外顯子894位點G／T的基因型頻率分布及風險系數 當eNOS基因啟動子－786位點及第七外顯子894位點的基因型為TT＋GG時，患病的相對風險度OR值為0.799，可見患病的風險度明顯減低。而如上兩基因位點的基因型為TC＋TT或CC＋TT時，患病的相對風險度OR值分別為1.511及1.676，可見患病的風險度明顯增高。可見TT＋GG可能是高血壓病的保護性基因，而可以看出CC＋TT除與高血壓的發病有一定程度相關性外，二者在高血壓的發病中可能具有一定程度的協同作用，見表3。

表3 兩組人群間eNOS基因啟動子及第七外顯子基因型和頻率分布及風險系數

3 討論

對于許多原因未明的疾病人們一直渴望在基因水平發現其發病的某些相關因素，一旦某一疾病的病因在基因水平得以闡明，那么發現這種疾病的最為行之有效的治療方式也將隨之成為可能。

有統計數字表明，隨著近年人們生活水平的日益提高，高血壓病的發病率呈現上升趨勢。與此同時心血管病的組成也有了改變，目前產前篩查方式的完善和抗生素的應用已使心血管病中的先天性心臟病和風濕性心臟病的比率大大減低，而人口的老齡化卻使高血壓性心臟病患者在心血管病中的比率大為增加。作為一種中老年人群中的常見病，高血壓病后果較為嚴重，其病因一直是研究熱點問題之一。

血管內皮不僅是血流與組織間液屏障的重要組成部分，也是血管功能的重要調節因子產地之一，血管內皮具有強大的旁分泌功能，其分泌多種血管活性物質用以調節血管的舒縮。一氧化氮（nitric ox－ide，NO）就是其中較重要的一種，NO又名內皮源性舒張因子，是一種作用極強的舒張血管物質，在調節血壓和維持血壓穩定中起重要作用。NO可調節血管的基礎張力和維持基礎血壓的穩定性。除此之外NO還具有較為強大的抗血栓作用，它可以抑制血管內皮損傷而引發的血小板聚集及粘附，可以拮抗血栓形成過程[3]。血NO水平下降是高血壓患者的危險信號之一[4]。已有研究表明，高血壓病的發生與進展與血管內皮損害、血小板激活并聚集及各種血管炎性因子異常表達有一定相關性[5]，也就是說與NO水平的異常密切相關[6]，不僅如此，NO水平的紊亂程度還與血壓自身節律性的破壞和靶器官損害有必然的相關性，因此，對于NO生成的限速酶基因的研究成為了近年高血壓病相關基因的研究熱點。

正常情況下人體內即有一定濃度的NO存在，NO是由L－精氨酸在NO合成酶（NOS）的作用下生成的，是一種生物效價很高的具有廣泛生物活性的信使分子。在哺乳動物中NOS主要有三種類型，分別為神經型、誘導型和內皮型，eNOS主要存在于血管內皮細胞，因而被稱為內皮型NOS，是在高血壓病的發生發展中最有可能起作用的NO合成限速酶[7]。

eNOS由1025個氨基酸殘基組成，相對分子量為13.3kDa。人eNOS基因定位于染色體7q35－q36，全長21－22kb，包括25個內含子和26個外顯子。eNOS基因存在多種多態性變異，但目前研究較多的是基因啟動子－786位點T／C及第七外顯子894位點 G／T多態性[8]。

啟動子是位于編碼基因上游的特異DNA序列，對于基因表達的轉錄水平起重要調節作用，是RNA聚合酶的結合部位，操縱著基因由DNA－RNA－蛋白質一級結構的啟始，而這一基因區的變異將會對RNA轉錄有一定程度的影響，也自然會對eNOS表達產生阻礙作用。而eNOS基因第七外顯子894位點所編碼的是eNOS蛋白一級結構中的第298位氨基酸，如果此位點發生G／T突變，則原來的谷氨酸（Glu）會被天門冬氨酸（Asp）所取代，而這一位點的谷氨酸正位于此蛋白質二級結構α螺旋的中心部位，Glu－Asp的錯義突變會導致eNOS二級結構構象發生變化，會由α螺旋轉變為β折疊，進而影響蛋白質三級結構的形成，也就自然會影響到eNOS的活性[9]。

當eNOS基因啟動子－786位點及第七外顯子894位點的基因型為TT＋GG時，患病的相對風險度低。而如上兩基因位點的基因型為TC＋TT或CC＋TT時，患病的相對風險度明顯增高。可見TT＋GG可能是高血壓病的保護性基因。而CC＋TT是如上兩基因位點同時突變的基因型，且兩基因位點雖未在eNOS表達同一水平起作用，但因最終均會影響到eNOS的效價，兩者在高血壓的發病中表現出的協同作用是發病中可能具有一定程度的協同作用是有科學依據的。事實上高血壓病的發病除與一定的遺傳因素相關外，還與許多環境因素及其他諸多外因有關[10]，雖如上兩基因位點同時突變對高血壓的發病有協同作用，但這并不表明具有如上基因型的人群就100%會患高血壓病。另外，在兩基因位點的協同作用研究上，因基因型分組較多，使得各組樣本量較小，要得到肯定性結論仍需加大樣本量進一步研究。

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