基于shotgun技術對鹿茸蛋白質組學的初步分析

魏征人，陳智嘉，劉 洋，趙 靜，于 鴻，吳 荻2，＊

（1.吉林大學白求恩醫學部基礎醫學院藥理學教研室，吉林 長春130021；2.吉林大學第一醫院腫瘤中心；

3.吉林省腫瘤醫院；4.吉林大學人獸共患病研究所人獸共患病研究教育部重點實驗室）

鹿茸是中國傳統的名貴中藥材，它是雄鹿鹿角成熟前未骨化、密生絨毛的幼角。具有促生長代謝、抗炎、免疫調節、抗衰老、促進傷口愈合及組織修復等多種藥理作用[1]。吉林省長春市雙陽區有300多年養鹿歷史，此地區養殖的梅花鹿是我國特有的梅花鹿品種。

鹿茸蛋白是從鹿茸中提取的一類具多種藥理活性的蛋白類物質，占濕鹿茸總質量的52%以上。近年來一系列研究發現鹿茸的主要生物學活性來自于其含量豐富的蛋白質、多肽和寡肽[2－6]。但中國傳統的鹿茸加工工藝多為煮炸式的熱加工，不易保留蛋白質及多肽類物質的活性。本課題組曾對雙陽梅花鹿鹿茸蛋白進行過免疫學活性評估、抗腫瘤等一系列藥理作用的研究，研究表明：總蛋白和按分子量截留的蛋白組分確有一定的免疫學活性及低度抑制某些腫瘤細胞系的細胞毒性作用[7]。但是因鹿茸蛋白組分復雜、成分繁多，目前藥理活性的重復驗證僅僅停留在大體水平上，為進一步弄清其蛋白組分和相關藥理活性的對應關系，從分子水平上揭示其導致多重藥理學活性的分子作用機制，本實驗特選雙陽梅花鹿春夏之際生長旺盛期的鹿茸進行研究，采用shotgun技術對吉林雙陽梅花鹿鹿茸中高表達蛋白進行了初步的蛋白組學研究和分析，旨在揭示其發揮生物學活性的物質成分基礎，為其進一步的臨床應用提供基礎實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑、儀器

雙陽梅花鹿優質二杠鹿茸購自吉林雙陽梅花鹿養殖基地。T J－6BECKMAN 離心機（美國Beckman公司）；HD－93－1型核酸蛋白檢測儀、FB－2型恒流泵（上海金達生化儀器有限公司）；酶標儀（Tecan sunrise奧地利）。檢測儀器型號：LTQ VELOS（Thermo Finnigan，San Jose，CA）；Trap柱：Zorbax 300SB－C18peptide traps（Agilent Technologies，Wilmington，DE）；Column：0.15MM＊150MM （RP－C18）（Column Technology Inc.），Sephadex G25、DEAE Sepharose（瑞典法瑪西亞公司），其余試劑均為國產分析純級。

1.2 鹿茸樣品的預處理

取吉林省雙陽梅花鹿鹿茸，將其切制成約1cm厚的茸片，倒入約200ml的生理鹽水溶液中，用勻漿機勻漿后，置于4℃冰箱中過夜，然后，將勻漿液于4℃，4 000rpm，離心20min。取上清液。配置33%的飽和硫酸銨溶液，用氫氧化銨將其pH調制約7.5，緩慢注入上清液中，放置4℃度沉淀48h。將沉淀懸起。裝入50ml離心管中，4 000r，20 min，棄上清液，用20mmol／L PBS溶解沉淀，待除鹽。

1.3 鹿茸蛋白的初步分離純化

1.3.1 Sephadex除鹽 將液體泵入Sephadex G－25柱體中（上樣前需用0.02mol／L PBS平衡柱體）。連接核酸蛋白紫外檢測儀，記錄各管流出液蛋白質吸光度值的變化，收集純化樣品放入－20度保存。

1.3.2 DEAE Sepharose分離蛋白 將蛋白樣品泵入盛有Sepharose FF柱中（上樣前需用20mmol／L Tris－Nacl pH＜8.0平衡。）將配置好的40mmol／L Tris－Nacl緩沖液pH＜8.0泵入柱中。洗滌蛋白雜質。配置 Tris（20mmol／L）－NaCI（1mol／L）高鹽緩沖液，將其與低鹽緩沖液分別加入梯度混合磁力攪拌器中，進行線性洗脫。并連接核酸蛋白紫外檢測儀，記錄各管流出液蛋白質吸光度值的變化，Sephadex G－25除鹽（方法同1.3.1）。然后將鹿茸蛋白組分I（洗脫峰I）送檢到中科院上海生化所蛋白質組中心、上海中科新生命生物科技有限公司進行shotgun分析。上海

1.4 shotgun方法對鹿茸蛋白質的解析

1.4.1 酶解 蛋白質溶液中加入終濃度10mM的DTT，37℃反應1h；然后加入終濃度50mM 的IAA，放置于暗處，反應40min；蛋白質溶液樣品用丙酮法沉淀；用25mM的碳酸氫銨復溶；加入1μg Trypsin，37℃反應20h。

1.4.2 毛細管高效液相色譜方法 A液為0.1%甲酸的水溶液，B液為0.1%甲酸的乙腈水溶液（乙腈為84%）。色譜柱以95%的A液平衡后，樣品由自動進樣器上樣到Trap柱。105min，B液線性梯度從4%到50%；105min至114min，B液線性梯度從50%到100%；114min至120min，B液維持在100%。

1.4.3 質譜數據采集 多肽和多肽的碎片的質量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描（full scan）后采集20個碎片圖譜（MS2scan）。

1.4.4 數據分析 原始文件（raw file）用 BIOWORKS軟件搜索相應的數據庫。最后得到鑒定的蛋白質結果。搜索使用的數據庫為Pecora蛋白庫，SEQUEST結果過濾參數為：當Charge＋1，Xcorr≥1.9；當Charge＋2，Xcorr≥2.2；當Charge＋3，Xcorr≥3.75；其中DelCN≥0.1。

1.5 生物信息分析

通過SEQUEST鑒定結果進行相應的GO功能學分析。首先進行gi號與IPI號的轉換，然后批量輸入到下列在線分析網站 http：／／61.50.138.118／gofact／cgi／gofact2009.cgi，進行生物過程分布、細胞定位和分子功能定位等分析[8]。

2 結果

DEAE Sepharose分離蛋白共得到3個洗脫峰，將洗脫峰I富集并進行shotgun分析，命名為鹿茸蛋白組分I，其shotgun質譜分析圖見圖1。

2.1 鹿茸蛋白組分I的一般理化性質

共分離出38個蛋白質，其中假想蛋白2個；2個蛋白無IPI號，共提交剩下的注釋蛋白34個；其中，蛋白質等電點（PI）跨度為3.71－12.01；相對分子質量（Mw）范圍（含蛋白片段）從9.7×103－3.3×105不等。

2.2 鹿茸蛋白組分I的的功能分類

按照IPI號對蛋白質成分進行GOA功能分類，分別是生物過程、細胞定位與分子功能分類。

圖1 鹿茸蛋白組分I的shotgun質譜分析圖

2.2.1 鹿茸蛋白組分I的生物過程分布 實驗鑒定出的34個蛋白質中，7個有生物過程注釋。按照生物過程主要分為5類，分別是生物過程調節6個（85.7%）；應激反應2個（28.6%），；細胞穩態1個（14.3%）；碳水化合物代謝1個（14.3%）；信號傳遞2個（28.6%）。參與生物過程的蛋白質占到鹿茸蛋白組分I總量的25.0%。

2.2.2 鹿茸蛋白組分I的細胞定位 實驗鑒定出的34個蛋白質中，13個有細胞定位注釋。主要分為4類，分別是細胞來源部分7個（53.8%）；細胞器來源4個（30.8%）；細胞外區域5個（38.5%）；蛋白質復合體1個（7.7%）。由此可見，所提呈的蛋白質中細胞內外分布較為均衡；參與細胞成分的蛋白質占到鹿茸蛋白組分I總量的46.4%。

2.2.3 鹿茸蛋白組分I的分子功能分類 實驗鑒定出的34個蛋白質中，15個有分子功能及其分類注釋。可分為3類，分別是結合10個（66.7%，其中核酸結合2個；蛋白質結合6個；離子結合5個）；具催化活性2個（13.3%）；具酶調節活性2個（13.3%）。可見鹿茸蛋白組分I中已知最多的為具有結合功能的蛋白質。參與分子功能的蛋白質占鹿茸蛋白組分I總量的53.6%。（注：有的蛋白可以既有生物過程注釋，還會有細胞定位抑或分子功能注釋。匯總表見表1）

從鹿茸蛋白組分I中發現的某些重要蛋白有：鹿從鹿茸蛋白組分I中發現的某些重要蛋白有：鹿茸膠原蛋白 Collagen alpha－1（III）；alpha－1（XII）；（XXII）等多種亞型；此外還有雌激素受體alpha；細胞骨架蛋白（vinculin）；細胞外基質蛋白（tenascin C）；穿膜神經肽受體（sortilin－related receptor）；細胞之間通訊的細絲蛋白（filamin）；鉀離子門控通道亞族 H（potassium voltage－gated channel subfamily H member 3）；著絲點蛋白（centromere protein）等。

表1 已鑒定的鹿茸蛋白功能統計

3 討論

“東北三寶”之一的鹿茸是我國傳統的名貴中藥材，是雄鹿密生茸毛未骨化的幼角。每年生長一次。吉林省是梅花鹿養殖大省，存欄量占全國的50%，就數量而言，無一省份或地區能與之匹敵；其中，鮮鹿茸年產量達255.45噸，占全國總量的60%以上，吉林省也因此獲得了“梅花鹿資源大省”的美譽。其中，長春地區的“雙陽梅花鹿”是我國特有的梅花鹿品種，其育種項目于1990年獲國家科技進步一等獎。但一直以來，東北地區所產鹿茸多被制成鹿茸片賤賣，鹿茸片的制作是采用傳統的煮炸工藝，其熱處理過程破壞了鹿茸中多肽和蛋白質的活性，而占鮮鹿茸總質量52%以上的多肽、蛋白質恰恰是鹿茸中最重要的成分。其具有調節免疫力、組織修復、抗腫瘤、抗衰老等多種生物學活性。

雖然國外在動物蛋白的分離、分析方面一直處于領先地位，但雙陽梅花鹿是我國特有品種，故未見國外的相關研究報道。蛋白組學的研究手段及生物信息學分析等日漸成熟，這些高技術的應用對于傳統中藥的現代化開發具有重要作用。鑒于此，本課題組自2009年即采用了蛋白組學流行的分離、分析手段對鹿茸蛋白組分進行了初步研究。其中，Shotgun方法在蛋白組學方面應用廣泛[9，10]，實踐證明是強有力的蛋白質組學分析鑒定工具，具操作過程簡單、分析速度快、分離效果好、重現性好和靈敏度高等優點。前期樣品無需復雜的處理，一般的蛋白粗提物或SDS－PAGE膠上挖取的蛋白皆可。本實驗所送檢的樣品是用DEAE離子交換層析獲取的洗脫峰I，經除鹽后，濃縮富集后得到。這樣的分段研究有助于我們對鹿茸多肽、蛋白研究程序化。便于找到有效的藥效學組分。也利于后續鹿茸蛋白的深加工和開發利用。

GO分析是Gene Ontology分析的簡稱，是生物學家為了衡量基因的功能而發起的一個項目，從分子功能（molecular function）、生物學過程（biological process）和細胞定位（cellular component）三個方面對蛋白功能進行全面定義[11]。是目前蛋白組學分析中常見的分析方法，經過這樣的分析和注釋，我們會對一個或一組蛋白質有一個全方位的了解和認識。從所鑒定的鹿茸蛋白組分中獲悉：生長期鹿茸中蘊藏著巨大的天然蛋白、多肽庫，單單是組分I就有很多重要蛋白，誠然，動物蛋白在人體的應用也受到多重限制，但是人類某些疾病的治療是從動物蛋白中得到啟發，本課題組曾在2010年對鹿茸蛋白提取液應用安全性問題進行過初步的研究[12]，發現鹿茸總蛋白經過口服、皮下、腹腔注射等給藥途徑，對小鼠組織器官有一定的病理性損傷，但不知這種損傷是否和其細胞毒性有關。為了更安全、更有效的開發和利用鹿茸多肽、蛋白。其蛋白組學的研究勢在必行，這將為吉林道地中藥材的研發提供基礎理論依據。

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