不穩定型心絞痛患者白介素—10基因1082G/A多態性分析

史雷忠+錢志宏+李銀福+倪悅+陳國琴

摘 要 目的：探討中國常州地區人群白介素-10（IL-10）基因1082G/A多態性與不穩定型心絞痛（UAP）發病的關系。方法：招募了299例研究對象并分成UAP組（n=146）和對照組（n=153），經測序鑒定IL-10 基因1082G/A多態性，并檢測血糖和血脂等生化指標。結果：IL-10 基因1082G/A在UAP組和對照組中均存在GG、AG和AA這3種基因型；3種基因型分布頻率、等位基因分布頻率與對照組相比均無統計學差異；調整對多個危險因素行多元logistic回歸分析，示IL-10 基因1082G/A 3種基因型與UAP的發病仍無相關性。結論：IL-10 基因1082G/A 多態性與中國常州地區人群UAP的發病無相關性。

關鍵詞 不穩定型心絞痛 白介素-10 基因多態性

中圖分類號：R541.4 文獻標識碼：B 文章編號：1006-1533（2014）21-0046-04

Polymorphism analysis of interleukin-10 gene 1082G/A

in patients with unstable angina pectoris

SHI Leizhong，QIAN Zhihong， LI Yingfu， NI Yue， CHEN Guoqin

（Department of Cardiology， The Peoples Hospital of Liyang City， Liyang 213300， China）

ABSTRACT Objective： To study the association between the polymorphism of interleukin-10（IL-10）gene 1082G/A and the incidence of unstable angina pectoris （UAP） in the Chinese Han population of Changzhou region. Methods： Two hundred and ninety-nine subjects were recruited and divided into a UAP group （n=146） and a control group （n=153）， who were free from coronary artery disease. The polymorphism of IL-10 gene 1082G/A from those subjects was identified by sequencing and meanwhile biochemical indicators such as blood sugar and blood lipid were determined. Results： There were three kinds of genotypes including GG， AG and AA in two groups and the distribution frequencies of their genotypes and alleles had no statistical difference and the logistic regression analysis of multivariate risk factors such as smoking， blood pressure， blood sugar， TG， TC， LDL， HDL showed that genotypes and the incidence of UAP had no correlation either. Conclusion： The polymorphism of IL-10 gene was no associated with UAP in the Chinese Han population of Changzhou region.

KEY WORDS interleukin-10； gene polymorphism； unstable angina pectoris

炎癥反應在不穩定型心絞痛（unstable angina pectoris，UAP）發病及發展過程中的作用得到越來越多的證實[1]，研究表明，白介素-10（IL-10）提高了動脈粥樣斑塊的穩定性，是粥樣硬化的保護因子[2]。目前發現IL-10基因啟動子具有多態性，IL-10合成的變化與基因變異有關[3]。UAP發病是遺傳因素和基因缺陷共同作用的結果[4]。在兩者共同作用下，各種炎性刺激因子形成炎癥導致易損斑塊的破裂是UAP發生的始動環節。1082G/A是IL-10基因的啟動子，有報道表明，其與冠心病及腦梗死發病有關[5-6]。本研究以中國常州地區人群為研究對象，探討IL-10基因——1082G/A單核苷酸多態性在UAP發病中的作用及臨床意義。

資料與方法

研究對象

入選的299例研究對象分別來源于常州市溧陽人民醫院和常州市武進醫院，均為2010年6月-2013年3月在心內科住院的患者，其中確診為UAP者146例作為UAP組，包含男106例，女44例，年齡 30～85歲，平均（65.57 ±10.55）歲，均符合ESC/ACC/AHA/WHF于2007年10月聯合頒布的關于UAP的診斷標準，并經行冠狀動脈造影證實存在冠狀動脈病變。選擇同期因胸悶、胸痛等原因住院行冠脈造影排除冠心病者153例作為對照組，包含男83例，女70例，年齡32～85歲，平均（60.98±10.43）歲。所有入選對象排除肝臟和腎臟疾病，惡性腫瘤，風濕類疾病，近期有急、慢性感染及炎癥者。所有入選對象均簽署知情同意書[7]。

研究方法

抽取研究對象外周靜脈血2 ml，置入EDTA抗凝管，用 DNA試劑盒抽提基因組DNA，-70 ℃冰箱保存。引物由上海生物技術工程有限公司合成，上游引物為5'-TGGCTCCCCTTACCTTCTACA-3'，下游引物為5'-GGGTGGGCTAAATATCCTCAA-3'。PCR擴增溶液共50 ?l，溶液內包括： 1 ?l 4×dNTP約50 ng、5 ?l Taq buffer、5 ?l 25 mmol/L MgCl2、1 ?l 10 pmol上、下游引物、0.5 ?l EXTaq 酶2.5 U和1 ?l DNA模板約100 ng， 35.5 ?l去離子水。循環參數：95 ℃預變性3 min，然后按94 ℃ 30 s，58 ℃ 35 s，進行35個循環，終末延伸72 ℃ 5 min。反應結束后，取PCR產物5 ?l， 1%瓊脂糖電泳，150 V、100 mA 20 min電泳觀察。然后純化PCR產物，并用回收試劑盒回收產物進一步測序鑒定IL-10基因啟動子——1082G/A位點基因型。同時采用全自動生化分析儀（奧林巴斯公司）測定三酰甘油（ TG）、膽固醇（TC）、低密度脂蛋白 （LDL-c）、高密度脂蛋白（HDL-c）和血糖（Glu）等指標。

統計學分析

應用SPSS 14.0軟件進行資料分析。組間計量資料以（）表示，用t檢驗；基因型和等位基因頻率比較及Hardy-Werberg平衡程度用χ2檢驗，用多元logistic回歸分析基因型與UAP發病的相關性，關聯程度用0R 和95% CI表示，P<0.05為差異有顯著性意義。

結果

UAP組與對照組的臨床資料比較

UAP組年齡大，男性多，吸煙者及糖尿病患者明顯多于對照組（P<0.01），兩組間高血壓、HDL-C等組成比較無差異，但發現UAP組TC、TG、LDL-c明顯增高（表1）。

基因多態性分型

IL-10——1082G/A基因多態位點經PCR擴增后獲得目的片段大小為140 bp，結果見圖1，圖2。

基因構成比比較

兩組中均存在GG、AG和AA這3種基因型，比較兩組間基因型頻率和等位基因頻率分布均無明顯差異（P>0.05）；調整年齡、性別（男性為1，女性為0）、吸煙、高血壓病、糖尿病、血脂對GG、AG 、AA這3種基因型行多個相關危險因素Logistic分析比較仍無相關性（P>0.05，表2）。

討論

UAP是冠狀動脈粥樣硬化引起血管內膜損傷、斑塊破潰脫落，繼發血小板激活、聚集、黏附、血栓形成，導致冠狀動脈的不完全閉塞，引起胸悶、胸痛，發病與炎癥反應密切相關[8]。

IL-10是分子量為30～40 kD的酸性蛋白，其成熟形式含有160個氨基酸，活性形式通常是通過二鍵構成二聚體多肽，其基因定位于第l號染色體上由5個外顯子及3個內含子組成，轉錄的mRNA長約2 Kb[9-10]，IL-10有廣泛生物學作用，在機體中主要起著免疫抑制和抗炎癥兩大作用，已發現IL-10與自身免疫性疾病（如潰瘍性結腸炎、Crohn病、風濕性關節炎等）的發病密切相關，且參與了心血管疾病的發病過程。

有研究表明，急性冠脈綜合征的患者IL-10的水平降低，并與惡性心血管事件的發生呈正相關[11]。實驗表明，急性冠脈綜合征患者氧化LDL刺激的巨噬細胞中，IL-10能減少血管泡沫細胞凋亡，說明IL-10能對抗氧化LDL誘導的泡沫細胞的凋亡，進一步提示IL-10提高了斑塊的穩定性，是粥樣硬化的保護因子。

IL-10基因啟動子具有多態性，IL-10合成的變化與基因變異有關。Turner等[3]發現IL-10基因啟動子——1082 G向A的轉變，在一定刺激下可使IL-10蛋白表達下調30%，Olivieri等[12]發現IL-10啟動子區域的1082 GG基因型表達增多和IL-10水平的增加，可以抑制慢性血管損傷引起的炎癥反應并減少動脈粥樣硬化合并癥的危險性。已有報道高加索人GA+AA基因型與冠心病發病相關[5]，表明IL-10 1082 GG基因型表達增多和IL-10水平的增加是血管性疾病的保護因子。

本研究共入選中國常州地區漢族人299例為研究對象，其中UAP組146 例，對照組153例，檢測了IL-10基因啟動子——1082G/A單核苷酸多態性，發現兩組均存在GG、AG、AA這3種基因型，且基因型分布符合HaIdy-Weinberg平衡。與對照組相比，UAP組3種基因型和A、G等位基因頻率分布無顯著差異，經多因素logstic回歸分析后發現，3種基因型與UAP的發病仍無相關性，結果提示，該基因變異不是中國常州地區漢族人群UAP發病的易感因素，且與國外研究相比，GG基因型明顯偏少，與國外研究存有較大的差異。分析可能有以下原因：①心血管疾病是一種復雜的多基因遺傳性疾病，種族差異所致遺傳易感性在不同人群種族中具有差異，而且外部環境因素也參與該疾病的發生和發展。②樣本存在不均一性，如性別、發病年齡等，本研究對象的平均年齡較大，兩組間存在較大年齡差異。③試驗設計不完全相同以及樣本量偏小，缺乏大規模的前瞻性研究。

綜上所述，不同種族人群中，IL-10基因——1082G/A多態性頻率差異較大，IL-10基因——1082G/A變異在中國常州地區人群中發生頻率與UAP的發病無顯著性相關。IL-10基因多態性與UAP的確切聯系及在心血管疾病中的預測價值尚需多中心、大樣本量的研究及在功能學方面的進一步研究。

參考文獻

Geisler T， Bhatt DL. The role of inflammation in atherothrombosis： Current and future strategies of medical treatment [J]. Med Sci Monit， 2004， 10（12）： RA308-RA316.

Von D， Thusen JH， Kuiper J， et al. Attenuation of atheoregnesis by systemic and local adenovirus-mediated gene transfer of inetleukin-10 in LDLr -/- mice[J]. FASEB J， 2001， 15（14）： 2730-2732.

Turner DM， Williams DM， Sankaran D， et al. An investigation of polymorphism in the interleukin-10 gene promoter[J]. Eur J Immunogenet， 1997， 24（1）： 1-8.

Margaret A， Nordlie MA， Loren E， et al. Genetic contributors toward increased risk for ischemic heart disease[J]. J Mol Cell Cardiol， 2005， 39（4）： 667-679.

Wang Y， Zheng J， Liu P， et al. Association between the Interleukin 10-1082G>A polymorphism and coronary heart disease risk in a Caucasian population： a meta-analysis[J]. Int J Immunogenet， 2012， 39（2）： 144-150.

張國忠.白細胞介素-1、10及腫瘤壞死因子基因多態性與腦梗塞相關性研究[D].廣州：第一軍醫大學， 2006.

錢志宏.妊娠相關血漿蛋白-A基因IVS6+95多態性與急性冠脈綜合征的相關性[D].鎮江：江蘇大學， 2010.

Lusis AJ. Atherosclerosis[J]. Nature， 2000， 407 （6801）： 233-241.

Halvorsen B， Waehre T， Scholz H， et al. Inlerleukin-10 enhances the 0xjdized LDL-induced foam cell formation anon of macrophges by antiaoptotic mechanisms[J]. J Lipid Res， 2005， 46（2）： 2ll-219.

Trompet S， Pons D， DE Craen AJ， et al. Genetic variation in the interIeukin-10 gene promoter and risk of coronary cerebrovascular events： the PROSPER study[J]. Ann N Y Arad Sci， 2007， 1100（1）： 189-198.

Yao I， Huang K， Huang D， et al. Acute myocardial infarction induced increases in plasma tumor necrosis factor-α and interleukin-10 are associated with the e activation of poly （ADP-rebose） polymerase of circulation mononuclear cell[J]. Int J Cardial， 2008， 123（3）： 366-368.

Olivieri F， Antonicclli R， Cardelli M， et al. Genetic polymorphisms of inflammatory cytokines and myocardial infarction on in the elderly[J]. Mech Ageing Dev， 2006， 127（6）： 552-559.

（收稿日期：2014-06-27）

Von D， Thusen JH， Kuiper J， et al. Attenuation of atheoregnesis by systemic and local adenovirus-mediated gene transfer of inetleukin-10 in LDLr -/- mice[J]. FASEB J， 2001， 15（14）： 2730-2732.

Turner DM， Williams DM， Sankaran D， et al. An investigation of polymorphism in the interleukin-10 gene promoter[J]. Eur J Immunogenet， 1997， 24（1）： 1-8.

Margaret A， Nordlie MA， Loren E， et al. Genetic contributors toward increased risk for ischemic heart disease[J]. J Mol Cell Cardiol， 2005， 39（4）： 667-679.

Wang Y， Zheng J， Liu P， et al. Association between the Interleukin 10-1082G>A polymorphism and coronary heart disease risk in a Caucasian population： a meta-analysis[J]. Int J Immunogenet， 2012， 39（2）： 144-150.

張國忠.白細胞介素-1、10及腫瘤壞死因子基因多態性與腦梗塞相關性研究[D].廣州：第一軍醫大學， 2006.

錢志宏.妊娠相關血漿蛋白-A基因IVS6+95多態性與急性冠脈綜合征的相關性[D].鎮江：江蘇大學， 2010.

Lusis AJ. Atherosclerosis[J]. Nature， 2000， 407 （6801）： 233-241.

Halvorsen B， Waehre T， Scholz H， et al. Inlerleukin-10 enhances the 0xjdized LDL-induced foam cell formation anon of macrophges by antiaoptotic mechanisms[J]. J Lipid Res， 2005， 46（2）： 2ll-219.

Trompet S， Pons D， DE Craen AJ， et al. Genetic variation in the interIeukin-10 gene promoter and risk of coronary cerebrovascular events： the PROSPER study[J]. Ann N Y Arad Sci， 2007， 1100（1）： 189-198.

Yao I， Huang K， Huang D， et al. Acute myocardial infarction induced increases in plasma tumor necrosis factor-α and interleukin-10 are associated with the e activation of poly （ADP-rebose） polymerase of circulation mononuclear cell[J]. Int J Cardial， 2008， 123（3）： 366-368.

Olivieri F， Antonicclli R， Cardelli M， et al. Genetic polymorphisms of inflammatory cytokines and myocardial infarction on in the elderly[J]. Mech Ageing Dev， 2006， 127（6）： 552-559.

（收稿日期：2014-06-27）

Von D， Thusen JH， Kuiper J， et al. Attenuation of atheoregnesis by systemic and local adenovirus-mediated gene transfer of inetleukin-10 in LDLr -/- mice[J]. FASEB J， 2001， 15（14）： 2730-2732.

Turner DM， Williams DM， Sankaran D， et al. An investigation of polymorphism in the interleukin-10 gene promoter[J]. Eur J Immunogenet， 1997， 24（1）： 1-8.

Margaret A， Nordlie MA， Loren E， et al. Genetic contributors toward increased risk for ischemic heart disease[J]. J Mol Cell Cardiol， 2005， 39（4）： 667-679.

Wang Y， Zheng J， Liu P， et al. Association between the Interleukin 10-1082G>A polymorphism and coronary heart disease risk in a Caucasian population： a meta-analysis[J]. Int J Immunogenet， 2012， 39（2）： 144-150.

張國忠.白細胞介素-1、10及腫瘤壞死因子基因多態性與腦梗塞相關性研究[D].廣州：第一軍醫大學， 2006.

錢志宏.妊娠相關血漿蛋白-A基因IVS6+95多態性與急性冠脈綜合征的相關性[D].鎮江：江蘇大學， 2010.

Lusis AJ. Atherosclerosis[J]. Nature， 2000， 407 （6801）： 233-241.

Halvorsen B， Waehre T， Scholz H， et al. Inlerleukin-10 enhances the 0xjdized LDL-induced foam cell formation anon of macrophges by antiaoptotic mechanisms[J]. J Lipid Res， 2005， 46（2）： 2ll-219.

Trompet S， Pons D， DE Craen AJ， et al. Genetic variation in the interIeukin-10 gene promoter and risk of coronary cerebrovascular events： the PROSPER study[J]. Ann N Y Arad Sci， 2007， 1100（1）： 189-198.

Yao I， Huang K， Huang D， et al. Acute myocardial infarction induced increases in plasma tumor necrosis factor-α and interleukin-10 are associated with the e activation of poly （ADP-rebose） polymerase of circulation mononuclear cell[J]. Int J Cardial， 2008， 123（3）： 366-368.

Olivieri F， Antonicclli R， Cardelli M， et al. Genetic polymorphisms of inflammatory cytokines and myocardial infarction on in the elderly[J]. Mech Ageing Dev， 2006， 127（6）： 552-559.

（收稿日期：2014-06-27）