貴州省某規模化豬場暴發豬偽狂犬病與大腸桿菌混合感染的診斷

李 達，湯德元，李春燕，羅險峰，曾智勇，劉 建，郝 飛，王洪光

（1.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省動物疫病預防控制中心，貴州 貴陽 550008）

2014年3月，貴州省開陽縣某規模化豬場送檢斷奶仔豬10頭，其中4頭死亡，6頭病危，1 d后其余病危的6頭相繼死亡。為了了解該豬場疫病的感染狀況，對該規模化豬場送檢的發病仔豬進行流行病學調查、臨床癥狀觀察、病理剖檢、細菌學和PCR技術診斷，確診為豬偽狂犬病和豬大腸桿菌混合感染。報告如下。

1 流行病學調查

該豬場斷奶仔豬未免疫豬偽狂犬病疫苗，發病突然，1～3 d共計有80頭斷奶仔豬發病，死亡36頭，病豬發熱，體溫升高到40.0℃～41.0℃，精神沉郁，食欲不振，喘氣，被毛粗亂，血液稀薄。發病后豬場曾使用青霉素、鏈霉素等抗生素進行治療，病豬體溫有所降低，但發病后2～3 d死亡。

2 臨床癥狀及剖檢病理變化

病豬主要癥狀是脫水和下痢，黃痢仔豬排黃色稀便，急性病例不見癥狀而昏迷死亡。白痢仔豬排出乳白色漿液狀、糊狀糞便。隨著病情的發展，出現食欲廢絕，有的眼屎多、眼瞼紅腫，眼圈發紫、結膜潮紅，有的病豬尖叫、磨牙，有的病豬耳朵發青、發紫、身體發紺，有的病豬出現呼吸困難，最后窒息死亡。

剖檢病理可見喉頭、扁桃體充血、皮下組織水腫；腸系膜淋巴結和下領淋巴結充血、腫大，間有出血；肺部有局灶性炎癥，并伴有充血、出血、淤血條紋和水腫，切開有泡沫；肝臟邊緣呈紫黑色、表面有許多散在的、顆粒狀大小不一的白色壞死斑點；腎臟表面有針尖大小出血點，腎臟切面有散在壞死點。

3 實驗室診斷

3.1 豬偽狂犬病ELISA初步檢測血樣 應用豬偽狂犬病ELISA試劑盒對抽取的10份血清進行檢測，檢測結果表明，由于該規模化豬場未接種偽狂犬病疫苗，根據送檢的10頭仔豬血樣采集進行的ELISA檢測陽性率達80%，從而初步診斷該規模化豬場存在PRV感染。

3.2 細菌分離培養及形態觀察 無菌采集取病死豬的肝、肺、腎、脾臟、腸系膜淋巴結病料同時進行接種普通瓊脂平板、血液瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板培養基上，置于含有5%CO2的37℃恒溫培養24～48 h后。淋巴結接種在普通營養瓊脂上形成直徑約2 mm的圓形、光滑、隆起、濕潤、半透明淡灰色的菌落；在麥康凱培養基上生長成較大的呈光滑、濕潤、圓形、隆起的粉紅色菌落，部分菌株在血液瓊脂平板上呈β溶血環。用接種棒挑取可疑菌落制成涂片進行革蘭染色，通過涂片鏡檢為兩端鈍圓的短小桿菌，偶有2～3個菌體相連，為革蘭陰性桿菌，符合大腸桿菌形態特性。

3.3 生化特性鑒定 將細菌純培養物接種于微量生化鑒定管中，置于含有5%CO2的37℃恒溫培養箱中培養24～48 h后，生化試驗鑒定結果表明，該分離株對硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、枸櫞酸鹽、尿素、半固體、賴氨酸、鳥氨酸、氨基酸對照、棉子糖、側金盞花醇、木膠糖12種發酵管反應呈陽性，對葡磷胨水、山梨醇2種發酵管反應呈陰性。其他生化試驗中，吲哚試驗陽性，V-P試驗陰性，枸櫞酸酸鹽利用試驗呈陰性，七葉苷水解試驗呈陽性，均符合大腸桿菌生化特性。

3.4 藥敏試驗 藥敏試驗采用世界衛生組織推薦的標準紙片瓊脂擴散法（disc agar diffusion），即（K-B法）操作。用接種環挑取1～2環純培養的分離菌，接種于含5%脫纖綿羊血的M-H瓊脂培養基上涂勻，選取12種常用藥敏紙片均勻地貼到培養基上，置于含有5%CO2的37℃恒溫培養箱中培養24～48 h后觀察結果，測定抑菌圈直徑。藥敏試驗結果表明，從該豬場分離的病原菌對頭孢唑啉、阿莫西林、慶大霉素和利福平高敏；對鏈霉素和妥布霉素中敏；而對氧氟沙星、諾氟沙星和四環素已經產生了耐藥性。

3.5 動物致病性試驗 取血液瓊脂平板上培養的24 h菌落制成細菌懸液(CFU為5×108個∕mL)，分別取0.5 mL采取腹腔注射接種在生長條件相同的10只小鼠，對照組10只注射等量生理鹽水。結果接種了分離菌的小鼠均在24～48 h內死亡，對照組沒有死亡。無菌取死亡小鼠的心臟、肝臟、淋巴結和脾臟等組織接種在鮮血瓊脂培養基上，結果經分離提純后鑒定，與以上特性相一致,確診為有大腸桿菌參與的混合感染。

3.6 PCR檢測 根據GenBank中PRV GDSH株（E F552427）和Guizhou-DY株（JX417716）的糖蛋白gE基因主要抗原表位序列，設計1對特異性引物（P1、P2），預計擴增片段大小為652 bp，擴增引物序列為（下劃線表示限制性內切酶酶切位點）：P1：5′-CGGGATCCGCCGACGACGATGACCTCAAC-3′，P2：5′-CGGAATTCCAGCGTGGCGGTAAAGTTCTC-3′。PCR反應采用25 μL體系：其中ddH2O 5 μL，2×GC BufferⅠ12.5 μL，dNTP 4.0 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，Taq酶0.5 μL。擴增程序為：95 ℃4 min；95℃1.5 min，58℃0.5 min，72℃1.5 min，35個循環；72 ℃10 min。對疑似PRV感染的病料進行提取病毒總DNA（按照DNA試劑盒上說明書進行提取），經PCR擴增后通過1%瓊脂糖凝膠電泳得到1條652 bp的片段，陰性對照未見條帶（見圖1）。測序后與預期結果相符，這說明送檢的病料確診為有PRV的混合感染。

4 討論

通過流行病學調查、臨床癥狀觀察、病理剖檢診斷及豬偽狂犬病ELISA檢測，初步診斷該規模化豬場斷奶仔豬疑似豬偽狂犬病病毒和大腸桿菌混合感染。通過進行細菌分離培養、生化特性、培養特性及動物致病性試驗鑒定確診該細菌為大腸桿菌。PCR結果顯示，送檢病豬中檢出了PRV核酸陽性條帶，測序后與預期結果相符，均為PRV，并且該規模化豬場斷奶仔豬并沒有接種豬偽狂犬病病毒疫苗，表明該豬場已經存在PRV感染。綜合分析以上結果，建議該規模化豬場緊急接種豬偽狂犬病病毒疫苗，加強飼養管理并合理投喂抗生素避免繼發感染，同時將可疑豬和病豬全部隔離飼養，病死豬及污染物則徹底焚燒或深埋，對污染的圈舍和四周環境進行嚴格消毒，患病豬群則隔離治療并帶豬消毒，對新購進豬要進行嚴格的隔離、檢疫，隔離期間定期進行血清學抗體檢測。藥敏試驗表明，該豬場在治療時可將頭孢唑啉、阿莫西林、慶大霉素和利福平作為治療仔豬大腸桿菌病的首選藥物。對于混合或多重繼發感染的情況，應當根據實驗室檢驗和藥敏試驗結果，對癥下藥，避免亂用藥而造成的仔豬的死亡。豬偽狂犬病病毒與大腸桿菌混合感染多表現為急性、發病快、病程短、死亡率高，一旦發病，將帶來很大的經濟損失，加上現在血清型眾多、現有疫苗效果較差、抗菌藥物的大量使用，大腸桿菌在選擇壓力下廣泛的產生耐藥性。因此，規模化豬場只有建立健全獸醫衛生防疫制度，搞好日常衛生管理工作，嚴格引種，堅持自繁自養，“全進全出”，合理使用預防藥物等綜合防制措施，才能最大限度的減少疫病的發生。