瓊脂擴散試驗檢測羊口瘡病毒

鮮思美，吳 健，楊 鈺，劉宗勝，劉 嬡，蘇 剛

（1.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省動物疫病研究所，貴州 貴陽 550025；3.畢節市七星關區農牧局草地中心，貴州 畢節 551700；4.畢節市動物產品質量安全監督檢驗所，貴州 畢節 551700）

羊口瘡（Orf）亦稱羊傳染性膿皰皮炎、羊傳染性膿皰口炎、羊傳染性膿皰，是危害山羊和綿羊的一種高度接觸性傳染病，其發病率為2.2%～17.7%，病死率為0～51.4%，羊口瘡在養羊的國家和地區普遍發生，常呈群發性流行，是嚴重威脅養羊業，具有重要經濟意義的病毒病。同時該病是一種急性、高度接觸性人獸共患傳染病，對人類健康構成威脅［1］。由于OrfV與其他許多病原(如口蹄疫病毒、羊痘病毒)感染動物后的臨床癥狀非常相似，臨床上極其容易造成誤診。目前，診斷Orf的方法有電子顯微鏡檢查、病毒分離、動物接種試驗、血清學方法、PCR擴增和LAMP技術等［2］，但相對于基層養殖場（戶）有必要尋找一種簡便、適用的血清學診斷方法。本試驗將羊口瘡痂皮毒回歸兔體，制備高免血清，進行瓊脂擴散（AGP）試驗，效果較好。報告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 選擇體重2 500 g以上，健康無病家兔，飼喂觀察7 d后供制備高免血清用。

1.2 受檢材料 Orf-HZ病料采自貴州省赫章縣；Orf-DF病料采自貴州省大方縣；Orf-ZY病料采自貴州省鎮遠縣；Orf-CQ病料采自重慶病料；Orf-CS病料，采自貴州省長順縣。羊口瘡細胞毒、健康山羊血清、兔血清和羊正常皮膚組織由本實驗室保存。

1.3 對照毒株 山羊痘疫苗，批準文號：新生藥字（2001）284403；口蹄疫病毒O型、亞洲I型二價滅活疫苗，批準文號：獸藥生字（2007）310017047。

1.4 兔抗羊口瘡病毒高免血清的制備［4］

1.4.1 羊口瘡痂皮毒抗原的制備 稱Orf痂塊毒1 g，加含10 000 IU/mL雙抗30 mL，充分研磨，超聲波乳化破碎3次后，4℃靜置過夜。以5 000 r/min離心15 min，取上清液，加含0.9%NaCl的PEG6000沉淀病毒，4℃過夜后，以10 000 r/min離心20 min，棄上清液，沉淀用適量生理鹽水溶解，裝入透析袋中0.9%NaCl透析24 h，包埋于PEG6000濃縮至10 mL，-20℃保存備用。

1.4.2 兔抗羊口瘡病毒高免血清的制備 取羊口瘡痂皮毒抗原1 mL，加入弗氏完全佐劑1 mL，混合均勻，制成包被抗原，于家兔的兩股內側和脊椎兩側皮內各注射10個點，第7天重復注射1次；第14天耳靜脈注射羊口瘡痂皮毒抗原0.5 mL，第21天再耳靜脈注射0.5 mL，同時在脊柱兩側皮內分兩點注射羊口瘡痂皮毒抗原各0.1 mL；第28天心臟采血，分離血清[7]，于滅菌瓶內-20℃保存備用。

1.5 瓊脂擴散試驗（AGP）

1.5.1 瓊脂板的制備 采用PEG平板，在普通平板的基礎上加聚乙二醇，操作術式按7孔型打孔。

1.5.2 瓊脂擴散試驗 在瓊脂板的中央孔加兔抗OrfV高免血清（已采用正常羊皮膚抗原吸收處理），周邊孔加被檢抗原，加樣完畢后，將平板放入濕盒內，放入37℃恒溫箱，20 h左右開始觀察，在陽性血清孔與被檢抗原孔之間出現明顯沉淀反應者即判為陽性。

1.5.3 兔抗羊口瘡高免血清最佳作用濃度的方陣分析［5］將所制得的兔抗OrfV高免血清加入中央孔，瓊脂擴散陽性抗原加入周邊孔，抗體、抗原分別作原液，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256倍比稀釋，抗體的每一個稀釋度分別與抗原的各稀釋度進行瓊擴試驗方陣分析，從而確定瓊脂擴散抗體的最佳濃度。

1.6 特異性試驗及其阻斷試驗

1.6.1 特異性試驗 取最適稀釋度的瓊脂擴散診斷抗體與山羊痘疫苗毒、口蹄疫疫苗毒作交叉試驗。

1.6.2 特異性阻斷試驗［6］為了進一步驗證瓊脂免疫擴散試驗檢測Orf病毒的特異性，筆者用兔抗Orf血清50 μL分別與50、100、150、200 Orf病毒和250 Orf病毒混合，37℃作用1 h。再與50 μL Orf病毒抗原進行瓊擴試驗觀察結果。

1.7 臨床疑似羊口瘡病料的抗原檢測 5份臨床疑似羊口瘡病羊的痂皮分別制成1∶1～1∶2的乳劑，經3次反復凍融后，離心，取上清液，作為待檢抗原分別與瓊脂擴散診斷抗體進行試驗。

2 結果

2.1 羊口瘡痂皮毒抗原與兔抗羊口瘡高免血清的AGP方陣分析 結果見（表1）。

表1 羊口瘡痂皮毒抗原AGP方陣分析結果

由表1可以看出，羊口瘡痂皮毒抗原從兔體制備的高免血清經瓊擴試驗檢測血清價為1∶16。與最高稀釋度抗原形成沉淀線的抗體的最高稀釋度為1∶4，實際檢測時以1∶4倍稀釋作為診斷抗體。

2.2 特異性試驗結果 取最適稀釋度診斷抗體與山羊痘疫苗毒、口蹄疫疫苗毒進行AGP，結果這2種陽性抗原與診斷抗體之間沒有出現沉淀線（圖1）；特異性阻斷試驗兔抗Orf血清50 μL與100、150、200 Orf病毒和250 Orf病毒抗原混合作用后，再與50 μL Orf病毒抗原進行瓊擴試驗，未見沉淀線（圖2）。

由圖1可知，1∶4倍稀釋的羊口瘡診斷抗體與羊口瘡痂皮毒和細胞毒之間出現明顯的白色沉淀線，而與羊口瘡陰性血清、生理鹽水、山羊痘疫苗毒和口蹄疫疫苗毒之間未見沉淀線；由圖2可知，50 μL羊口瘡陽性血清能被100、150、200痂皮毒和250的痂皮毒特異性阻斷，表明應用兔抗羊口瘡高免血清來檢測羊口瘡病毒抗原的反應是特異的。

2.3 臨床疑似羊口瘡病料的抗原檢測結果 對5例不同地區臨床疑似羊口瘡痂皮毒抗原的檢查結果：CS病料、ZY病料和DF病料均是在2 h出現明顯的沉淀線，CQ病料、HZ病料在20 h后出現沉淀線（圖3）。

3 小結和討論

3.1 本試驗中用痂皮毒抗原從兔體制備的高免血清效價為1∶16；抗體1∶16倍稀釋，可檢測到1∶4倍稀釋的痂皮毒抗原，而抗體作1∶4倍稀釋，則可檢測到1∶128倍稀釋的痂皮毒抗原，為了避免漏檢，我們認為高免血清1:4倍稀釋是診斷用抗體的最佳濃度。

3.2 羊口瘡痂皮毒抗原制備兔抗Orf高免血清瓊擴效價與王廷璞等［4］報道一致，均為1∶16，這與Orf V具有高度的嗜上皮性，主要引起局部強烈的免疫反應，且以細胞免疫為主，體液免疫水平較低有關。通過方陣分析后，診斷抗體濃度為1∶4應用于5份臨床疑似病料的檢測取得了很好的效果，而健康山羊血清和兔血清不和待檢抗原產生沉淀線。

3.3 痂皮毒抗原免疫家兔制備的高免血清在未經處理的情況下，能與相應的痂皮毒抗原產生沉淀線，同時也可以和羊正常皮膚抗原產生沉淀線；采用羊正常皮膚抗原吸收處理后的兔抗羊口瘡高免血清再進行瓊擴反應，與痂皮毒抗原產生沉淀線，而與正常皮膚抗原不產生沉淀線，說明該診斷抗體經羊正常皮膚抗原吸收處理后可以用來診斷本病。

3.4 山羊痘病毒、口蹄疫病毒和羊口瘡病毒感染羊在臨床癥狀和病理變化相似，難以及時鑒別診斷。山羊痘抗血清能中和羊口瘡病毒，但羊口瘡血清不能中和山羊痘病毒，羊口瘡高免血清作為診斷抗體通過特異性試驗及其特異性阻斷試驗，結果表明，應用兔抗羊口瘡高免血清來檢測羊口瘡病毒抗原的反應是特異的，不與GPV、FMDV抗原發生交叉反應，這一診斷方法可將GPV與OrfV引起羊的皮膚癥狀為主的疫病區別開來。所以，建立該方法具有重要的應用價值。

[1]張家確，吳景央.一起人畜共患羊傳染性膿皰病的調查[J].中國獸醫雜志，2006，42（9）：53-54.

[2]劉永杰，張克山，孔漢金，等.羊傳染性膿皰診斷技術研究進展[J].動物醫學進展，2013，34（2）：96-99.

[3]王廷璞，薛雙虎，呂武夫，等.酶聯免疫吸附試驗檢測羊傳染性膿皰病毒[J].甘肅畜牧獸醫，1995，1：3-4.

[4]鮮思美.應用瓊脂擴散試驗檢測新城疫抗原[J].貴州畜牧獸醫，2002，26（2）：5-6.

[5]程安春.瓊脂擴散試驗檢測雛鵝新型病毒性腸炎病毒及抗體的研究[J].中國獸醫雜志，1999，25（3）：3-6.