一株豬圓環(huán)病毒2型全基因組的克隆與序列分析

王偉丞，梁海英，曾智勇，湯德元，劉 釗

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)場，貴州 貴陽 550025）

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原。PMWS于1997年首次在加拿大報(bào)道，隨后在美國、法國、德國、日本等多個(gè)國家相繼報(bào)道。近年來該病在我國普遍流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。2000年郎洪武等首次報(bào)道中國豬群存在PCV2感染，陽性率為42.9%[2]。2007年周緒斌等報(bào)道在2000-2005年間20多個(gè)省市PCV2感染平均陽性率達(dá)55.04%[3]。根據(jù)崔亞蘭等對(duì)貴州省2007-2011年豬圓環(huán)病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，PCV2在貴州省的感染日益嚴(yán)重[4]；另根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室對(duì)2011-2012年間貴州部分地區(qū)的PCV2血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，PCV2野毒感染的陽性率高達(dá)61.3%[5]。如今PCV2及其所致的相關(guān)疾病越發(fā)嚴(yán)重，已成為研究的熱點(diǎn)。

2013年12月上旬，貴州省開陽縣某豬場10日齡左右的仔豬發(fā)生體溫升高、下痢、皮膚發(fā)紅、極度消瘦為特征的急性傳染病，并導(dǎo)致仔豬大量死亡，12月中旬該豬場送檢1頭病死仔豬以確定病原感染類型，經(jīng)豬繁殖障礙性病毒性疫病6重PCR檢測方法[6]診斷為PCV2和PRRSV混合感染。為了解該毒株的分子遺傳背景，試驗(yàn)針對(duì)PCV2全基因設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，對(duì)該毒株進(jìn)行全基因組的擴(kuò)增、克隆和序列分析，旨在給貴州省PCV2的流行病學(xué)研究、診斷與防控、疫苗免疫等提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源 病料樣品系貴州省開陽縣某豬場送檢的疑似PMWS的1頭病死仔豬。

1.2 主要試劑 DNA提取試劑盒，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；LA Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ、DL-2 000、pMD19-T Simple Vector，購自寶生物工程（大連）有限公司；E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit，OMEGA公司產(chǎn)品；普通質(zhì)粒小提試劑盒為TIANGEN公司產(chǎn)品；大腸桿菌感受態(tài)TOP10（貴州省動(dòng)物疫病研究室制備和保存）；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上已發(fā)表的PCV2序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物擴(kuò)增全序列：

PCV2-S：5′-CCCAAGCTTCTTTTTTATCACTTC GTAATGGTTTT-3′；

PCV2-As：5′-GGTGGATCCACTCAGTAATTTA TTTCATATGGA-3′。

分別在引物兩端引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)（劃線部分），引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 病毒DNA的提取 取送檢病死仔豬淋巴結(jié)、腎臟、脾臟等組織用PBS按1∶5倍稀釋研磨，制成乳懸液，-80℃反復(fù)凍融3次后，8 000 r/min離心15 min，取上清按照DNA提取試劑盒操作步驟提取病毒核酸，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCV2全基因組的克隆與測序 利用設(shè)計(jì)的PCR引物，以上述制備好的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：模版DNA 5.0 μL，10×LA Taq Buffer 5.0 μL，dNTP Mixture 8.0 μL，上下游引物各1μL，LA Taq 0.5 μL，ddH2O 29.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94℃熱變性1 min，57℃退火40 s，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

將3個(gè)目的基因片段按照常規(guī)方法分別克隆到pMD19-T Simple載體中，進(jìn)行PCR、酶切和測序鑒定。

1.6 序列分析 應(yīng)用DNAStar 7.0和MEGA5.0生物學(xué)軟件對(duì)克隆的PCV2全基因組序列與Gen-Bank中查得的PCV2全基因組核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 病料PCR的擴(kuò)增 以組織中提取的病料核酸為模版，應(yīng)用上述特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，擴(kuò)增出1條與預(yù)期片段大小1 800 bp左右的特異性條帶（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 將純化的PCR產(chǎn)物連接至pMD19-T Simple載體，重組質(zhì)粒pMD19-TPCV2經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，均獲得大小約1 800 bp的與預(yù)期片段大小一致的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符（圖2）。

2.3 序列分析 測序結(jié)果表明，該毒株基因組全長為1 767 bp，GenBank登錄號(hào)為KJ139962，將其命名為GZ-KY1株。與從GenBank收錄的毒株序列中選取的20株不同國家和地區(qū)的PCV2毒株進(jìn)行核苷酸序列相似性比對(duì)分析，結(jié)果表明，所有PCV2毒株之間的序列相似性均相對(duì)較高，介于94.1%～98.4%之間，其中GZ-KY1與GQ359008(上海)的毒株的相似性最高為98.4%，與EU148504（丹麥）毒株相似性最低分別為94.1%，與疫苗株LG(HM038034)和SH(AY686763)的相似性分別為95.0%和96.3%。

為了更好地了解PCV毒株的遺傳學(xué)特性及相互間親緣關(guān)系，應(yīng)用MEGA5.0軟件，以相關(guān)PCV2毒株全基因組核苷酸序列，繪制了系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹（圖3）。根據(jù)2008年歐盟豬圓環(huán)病毒疾病委員會(huì)基因分型的標(biāo)準(zhǔn)[7]，可將PCV2 KJ139962-GZKY1（開陽）株劃歸為PCV2b基因型，且貴州株JQ809463-GZ-QZ1（清鎮(zhèn)）和JQ809464-GZ-RH1（仁懷）均屬于PCV2b基因型，僅JQ809462-GZCS1（長順）株屬于PCV2a基因型，表明貴州地區(qū)流行的PCV2基因型以2b型為主。

3 討論

PCV2相關(guān)疾病已成為危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病，其單獨(dú)感染較少，常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒等混合感染，表現(xiàn)出嚴(yán)重的臨床癥狀和較高的死亡率。PCV2主要分為PCV2a，PCV2b，PCV2c三個(gè)亞型，其中PCV2a主要在歐美等國家和亞洲的日本、韓國、中國臺(tái)灣等；PCV2b包含了加拿大、美國、巴西、中國等；PCV2c僅在丹麥有報(bào)道。有學(xué)者認(rèn)為PCV2的不同基因型毒力不同，普遍認(rèn)為PCV2b的致病力要強(qiáng)于PCV2a，且在1998-2002年間我國流行的豬圓環(huán)病毒主要以PCV2a亞型為主，2002年以后PCV2a亞型較少，主要以PCV2b為主[8]。

本試驗(yàn)從貴州開陽地區(qū)疑似PMWS病料中通過PCR擴(kuò)增獲得了一株P(guān)CV2全基因序列。經(jīng)序列分析表明，該毒株屬于PCV2b亞型，且本實(shí)驗(yàn)室先前分離的3株P(guān)CV2毒株中，2株P(guān)CV2b亞型，1株為PCV2a亞型，表明貴州地區(qū)流行的豬圓環(huán)病毒也以PCV2b為主。與國內(nèi)外參考毒株之間的相似性在94.1%～98.4%之間，表明所有PCV2毒株之間的親緣關(guān)系均較近，基因組比較保守，但近年來我國也有PCV2基因組大小為1 766 bp的報(bào)道，這可能是PCV2變異所致[9-10]，這些變異是否和毒力以及臨床癥狀有關(guān)有待進(jìn)一步研究。

目前PCV2已經(jīng)在我國豬場廣泛存在，豬場對(duì)于PCV2的防控除加強(qiáng)飼養(yǎng)管理外，還需要對(duì)混合感染的其他病原作適當(dāng)?shù)闹鲃?dòng)免疫和被動(dòng)免疫，預(yù)防性給藥治療控制細(xì)菌性疾病的混合感染或繼發(fā)感染，同時(shí)開展有效的綜合性防制措施，才能起到事半功倍的效果[11]。

[1]Li W，Wang X，Ma T，et al.Genetic analysis of porcine circovirus type 2(PCV2)strains isolated between 2001 and 2009：genotype PCV2b predominate in postweaning multisystemic wasting syndrome occurrences in eastern China[J].Virus Genes，2010，40（2）:244-251.

[2]郎洪武，張廣川，吳發(fā)權(quán)，等.斷奶豬多系統(tǒng)衰弱綜合征血清抗體檢測[J].中國獸醫(yī)科技，2000，30（03）:3-5.

[3]周緒斌，張馨玉，許秀梅.我國豬圓環(huán)病毒2型的流行情況和分析[J].中國豬業(yè)，2007（05）:37-41.

[4]崔亞蘭，王開功，張華，等.2007-2011年貴州省豬圓環(huán)病毒感染的流行病學(xué)調(diào)查[J].畜牧與獸醫(yī)，2013，45（03）:70-73.

[5]王偉丞，曾智勇，劉志杰.貴州省幾種豬繁殖障礙性疫病抗體水平檢測[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（05）:118-120.

[6]劉志杰，曾智勇，湯德元，等.豬繁殖障礙病毒性疫病六重PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，43（09）:1429-1436.

[7]Cortey M，Olvera A，Grau-Roma L，et al.Further comments on porcine circovirus type 2（PCV2）genotype definition and nomenclature[J].Vet Microbiol，2011，149:522-523.

[8]黃新，康立超，韓猛立，等.豬圓環(huán)病毒2型XJ-SW株全基因組的克隆與序列分析[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2012，42（5）:461-466.

[9]郭龍軍，陸月華，危艷武，等.我國部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型分離株的遺傳變異分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，31（11）:856-859.

[10]Shang S B，Jin Y L，Jiang X T，et al.Fine mapping of antigenic epitopes on capsid proteins of porcine circovirus and antigenic phenotype of porcine circovirus type 2[J].Mol Immunol，2009，46（3）:327-334.

[11]賈懷杰，王曉霞，房永祥，等.豬圓環(huán)病毒2型甘肅株全基因組克隆及序列分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，37（1）:1-6.