附麻平喘方對哮喘模型大鼠的作用與機制的實驗研究

邢亞群 王迪生 龍子江

(1蚌埠醫學院第二附屬醫院藥劑科，蚌埠，233000;2安徽省合肥市安徽中醫藥大學藥理學教研室，合肥，230038)

哮喘是支氣管哮喘的簡稱，該證是由肥大細胞，嗜酸性粒細胞和淋巴細胞參與的慢性持續性氣道炎性反應性疾病，屬于Ⅰ型超敏反應，臨床上以痰、咳、喘為其主癥。目前西醫臨床采取抗炎解痙為主的治療原則，使用β－受體激動劑、糖皮質激素、茶堿等藥物治療取得了一定的療效，但不良反應大，遠期療效不很理想。中醫治療該證有長期的臨床經驗，附麻平喘方是臨床經驗方，本實驗通過觀察該方對實驗大鼠血漿IL－4、IFN－γ、IgE，促腎上腺皮質激素(ACTH)，血清皮質酮(CORT)等改變，探討該方對哮喘大鼠的治療功效與作用機制[3－7]。

中醫學將該病歸于“哮”證和“喘”證的范疇，臟腑功能失調或虛弱等均可引起痰鳴氣喘等證。在臨床上有眾多的證型分類，有的以病性分型，如冷哮(寒哮)、熱哮、虛哮;有以病因分型，如風哮、痰哮;有的按發作期、緩解期分類，且以虛實為綱[8]。盡管分型眾多，但它的治療離不開肺與腎，特別是久咳久喘或腎虛性患者。故重視標本兼治也已成為治療這類哮喘患者的一條重要治則。附麻平喘方根據這一治則合理組方，用于治療支氣管哮喘。

1 材料與方法

1.1 藥物 試驗藥物為附麻平喘方，該藥由下列中藥顆粒劑(江陰天江藥業生產)組成:附子10 g(批號:120518)、麻黃 10 g(批號:120606)、桂枝10 g(批號:120810)、細辛 3 g(批號:120703)、青皮 10 g(批號:130219)、甘草5 g(批號:121007)、決明子10 g(批號:120613)、白芍15 g(批號:120308)、熟地黃20 g(批號:130128)、紫菀10 g(批號:121105)、蘇子10 g(批號:130307)、淫羊藿15 g(批號:120627)、巴戟天10 g(批號:120908)等中藥組成。上述中藥飲片按中藥常規方法煎煮3次，合并藥液，制成濃度為5 g/mL的水煎液，所給劑量按人與動物的劑量換算所得，并經預實驗調整。陽性對照藥為補腎防喘片(太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司生產，批號11120008)，臨用時配成相應濃度使用。

1.2 動物 未曾交配的4～5月齡SPF級SD大鼠60只，均為雄性，體重(200±20)g，由安徽醫科大學動物中心提供，動物合格證書號:SCXK(皖)2011－002。室溫22～25℃、相對濕度為40% ～50%，普通飼料喂養，自由攝水。

1.3 主要試劑 氫氧化鋁(江蘇永華精細化學品有限公司，批號:20120909);卵清蛋白(Sigma公司分裝);甲醛(上海蘇懿化學試劑有限公司，批號:20121110);生理鹽水(開開援生制藥股份有限公司，批號:2092864);水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司生產，批號:20110304)，磷酸鹽緩沖液，(萬新試劑，批號:1112130101);ACTH ELISA試劑盒、CORT ELISA試劑盒(上海源葉生物技術有限公司，批號分別為:10805R，10332R)，β–腎上腺素受體試劑盒(北京博奧森，批號:998825006W)。

1.4 實驗儀器與設備 漩渦混合器，其林貝爾儀器制造公司，型號:GL－88B;超聲霧化器(江蘇魚躍醫療設備股份有限公司，批號:1203001);ALC210型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司);酶標儀，雷杜，型號:RT－6000;離心機:安徽嘉文，型號:JW3021HR;電熱恒溫箱:上海三發，型號:DNP－9052BS－Ⅲ;分析天平:北京賽多利斯儀器系統有限公司;移液器，eppendorf;電爐(上海日用電爐廠);電子天平(上海天平儀器廠)。

1.5 實驗方法 動物分組及給藥:取雄性SD大鼠60只，適應性飼養1周后，除正常組外，其他大鼠分別于第1、7天腹腔注射10%卵清白蛋白(OVA)混懸液1 mL(含OVA 100 mg+氫氧化鋁100 mg)。正常組注射生理鹽水 1 mL，各組完成致敏階段[5，9－10]。然后采用隨機數字表法分為5組。正常對照組(等容量的蒸餾水)、哮喘模型組(等容量的蒸餾水)、陽性藥物組(377.5 mg/kg)，附麻平喘方高劑量組(49.68 g/kg)，附麻平喘方中劑量組(24.84 g/kg)及附麻平喘方低劑量組(12.42 g/kg)，每組各10只。第15天起模型組與各給藥組分別放于5 L自制玻璃霧化箱內，第1、2周以1%OVA進行霧化吸入激發，1次/d，20 min/次，每2周濃度提高0.5%，共霧化8周，正常組則霧化生理鹽水替代OVA。給藥容積為1 mL/100 g體重。

1.6 檢測指標

1.6.1 血清 IL－4，IFN－γ，IgE的檢測 末次給藥后，禁食24 h，不限水，用3.5%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈抽血后處死。分離取血清及血漿，血清用于IL－4，IFN－γ，IgE的檢測。該檢測采用生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELASA)。

1.6.2 血清CORT和血漿ACTH的檢測 末次給藥后，禁食24 h，不限水，用3.5%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈抽血后處死。分離取血清及血漿，血清用于CORT含量檢測，血漿用于ACTH含量檢測。

1.6.3 肺組織病理形態學檢測 取肺臟稱重，用10%甲醛固定后，以備HE染色觀察肺組織病理變化。

1.6.4 肺組織β－AR的檢測 取另一側肺臟，采用免疫組化法檢測肺組織β–AR的含量。計算公式:免疫組織化學指數=GR表達陽性面積×平均光密度值。

1.7 數據分析 采用SPSS 19.0軟件進行統計學處理。數據結果以(±s)表示，定量資料每組實驗前后比較采用配對樣本t檢驗，多組間兩兩比較采用方差分析(方差齊的采用LSD檢驗，方差不齊者采用Dunnettt檢驗)。

2 結果

2.1 哮喘模型大鼠病理形態學的觀察 正常組大鼠肺無實質性異常炎性反應改變，氣道黏膜上皮及肺泡結構完整，肺泡間隔窄，氣道平滑肌薄，未見炎性細胞浸潤。模型組大鼠氣道和支氣管壁周圍有大量的炎性細胞浸潤，支氣管平滑肌層肥大、增生，黏膜充血、水腫，氣道腔內上皮脫落、受損，管腔內充滿大量的黏性分泌物，肺泡結構亦出現紊亂、融合現象。補腎防喘片組大鼠肺泡結構較好，與正常對照組相似，支氣管上皮結構較完整，氣道平滑肌層稍增生，腔內無明顯分泌物，支氣管及肺泡炎性細胞浸潤亦輕于模型組。附麻平喘方高，中劑量組的肺泡壁毛細血管擴張、充血程度較模型組減輕，支氣管上皮結構完整，腔內無明顯分泌物，肺泡結構較完整，肺泡腔內無明顯炎性物質滲出。附麻平喘方低劑量組支氣管周圍有較多的炎性細胞，支氣管平滑肌增生強于高，中劑量組，肺泡有融合現象，結果見圖1。

圖1 HE染色檢測哮喘大鼠肺組織病理學變化×200

2.2 附麻平喘方對哮喘模型大鼠CORT和ACTH的影響 與正常對照組比較，模型組ACTH，CORT值明顯降低(P＜0.01);與模型組比較，陽性組CORT(P＜0.01)和 ACTH(P＜0.05)升高，高劑量組 CORT，ACTH值升高(P＜0.05)，中劑量組和低劑量組CORT和ACTH值升高差異有統計學意義(P＜0.01)，見表1。

表1 附麻平喘方對CORT，ACTH水平的影響(±s，n=10)

表1 附麻平喘方對CORT，ACTH水平的影響(±s，n=10)

注:與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 CORT(ng/mL) ACTH(pg/mL)正常組 343.16±48.41＊＊ 129.80±22.90＊＊模型組 261.69±34.92 70.47±16.66補腎防喘片組 342.46±41.25＊＊ 102.69±12.94*附麻平喘方高劑量組 304.81±63.65* 95.79±25.40*附麻平喘方中劑量組 342.47±49.84＊＊ 110.03±30.98＊＊附麻平喘方低劑量組 353.75±36.21＊＊ 104.46±28.00＊＊

2.3 附麻平喘方對哮喘模型大鼠肺組織β－AR免疫組化指數的影響 與正常對照組比較，模型組β－AR明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.01);與模型組比較，陽性組β－AR升高且差異有統計學意義(P＜0.01);附麻平喘方高、中劑量組β－AR升高，差異有統計學意義(P＜0.01);低劑量組β－AR升高差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

2.4 附麻平喘方對哮喘模型大鼠IL－4，IFN－γ，IgE的影響 與正常對照組比較，模型組IL－4，IgE值升高，IFN－γ值降低(P＜0.01);與模型組比較，陽性組，中劑量組和低劑量組IL－4值降低差異有統計學意義(P＜0.01)，高劑量組差異有統計學意義(P＜0.05);陽性組，中劑量和低劑量組IFN－γ值升高且差異有統計學意義(P＜0.05);陽性組IgE值降低差異有統計學意義(P＜0.01)，高劑量組和中劑量組降低差異有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

表2 附麻平喘方對β–AR免疫組化指數影響(±s，n=10)

表2 附麻平喘方對β–AR免疫組化指數影響(±s，n=10)

注:與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 劑量(g/kg) β－AR正常組——205.61±25.45＊＊模型組——60.30±9.87補腎防喘片組 0.38 128.82±19.03＊＊附麻平喘方高劑量組 49.68 156.48±13.14＊＊附麻平喘方中劑量組 24.84 105.56±21.82＊＊附麻平喘方低劑量組 12.42 90.74±10.66*

表3 附麻平喘方對IL－4，IFN－γ水平的影響(±s，n=10)

表3 附麻平喘方對IL－4，IFN－γ水平的影響(±s，n=10)

注:與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01。

＊＊正常組 89.21±11.24＊＊ 194.95±29.45＊＊ 16.94±3.45模型組 128.02±24.41 136.22±27.33 21.85±3.49補腎防喘片組 93.21±13.32＊＊ 165.23±27.09* 17.03±3.39＊＊高劑量組 107.29±24.22* 146.26±28.55 17.48±2.93*中劑量組 93.17±26.56＊＊ 182.19±26.91＊＊ 17.88±1.76*低劑量組 104.72±20.66* 168.00±29.65*19.11±2.67

此外，模型組大鼠與正常對照組相比在“望診”方面出現了皮毛無澤、豎立，大小便量增多，身體消瘦，動作遲鈍，精神不振，蜷臥等癥狀，同時伴見呼吸急促，喘息，哮鳴音，口鼻四肢發紺，嚴重者，甚至出現了明顯的喘促聲或打噴嚏、搔鼻、咳嗽等現象，提示該組大鼠出現了哮喘的癥狀，各給藥組上述癥狀均不同程度減輕、好轉。

3 討論

現代醫學認為哮喘的病理生理變化涉及到免疫系統和神經內分泌系統多個環節，其中下丘腦－垂體前葉－腎上腺皮質與單核－巨噬細胞環路是目前與哮喘等應激有關的研究較多的一個環路，即HPA(下丘腦－垂體－腎上腺皮質)軸。研究發現，哮喘患者HPA(下丘腦－垂體－腎上腺皮質)軸功能低下[9]，特別是糖皮質激素水平較低。

哮喘是以肥大細胞反應，嗜酸性粒細胞浸潤為主的慢性氣道炎性反應性疾病;T淋巴細胞的2種亞型Th1、Th2的失衡與哮喘的發作密切相關，Th2細胞過度表達可導致哮喘發作，因此Th1、Th2的比值也成為相關實驗研究判定治療結果的指標之一[10];IFN－γ、IL－4分別是Th1和Th2細胞的特征性細胞因子[11]。哮喘患者Th1細胞功能下降，Th2細胞功能異常增高，以致IFN－γ分泌減少，IL－4分泌增多，因此IFN－γ在相關研究中作判定治療結果的指標之一[12]。它們作為一種重要的趨化因子，對引起哮喘發作的各種效應細胞如嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、T細胞及IgE均有較強的趨化作用，可趨化嗜酸性粒細胞向氣道聚集后，嗜酸性粒細胞可釋放炎性遞質白三烯、血小板活化因子等，造成氣道細胞組織的炎性損傷，又直接導致氣道痙攣，并最終可導致氣道反應性的增高。

本實驗研究結果也與上述哮喘機制相吻合:模型組ACTH和CORT主要的檢測指標明顯偏低，附麻平喘中劑量組的ACTH和CORT指標高于模型組，并且差異有統計學意義，這一結果表明附麻平喘方通過附麻平喘方治療哮喘的作用機制與提高ACTH和CORT水平有關。

糖皮質激素對哮喘發病機制的干預是通過抑制炎性反應細胞的遷移和活化，抑制細胞因子的生成，抑制炎性反應遞質的釋放等實現的。本實驗的研究結果與這一機制相吻合:模型組血清IFN－γ分泌減少，IgE、IL－4分泌增多;附麻平喘中、低劑量組IL－4、IL－8水平均低于模型組;其中、低劑量組IFN－γ水平均高于模型組、上述差別均有統計學意義。此外，哮喘患者氣道緊張度增高，β2受體功能相對降低，也是哮喘發病因素之一，糖皮質激素水平升高可增強平滑肌細胞β2受體的反應性，有利于哮喘的緩解與減輕，本實驗研究結果也證實了這一作用。

中醫學對哮喘癥的治療由來已久，既是在中西醫對照的情況下仍取得良好療效。中醫學認為臟腑功能失調或虛弱，或因六邪七情、瘀血等致肺氣不宣，氣機上逆;或致濕濁內生聚而生痰;或痰氣相搏，氣道攣急等均可引起痰鳴氣喘等證。在臨床上有眾多的證型分類，但肺主呼，腎主吸，與肺腎有密切關系，特別是久咳久喘患者精氣耗損，傷及元氣，出現腎虛性癥狀。故重視補腎虛以治本[13]，宣降肺氣等以治標，標本兼治成為治療這類哮喘患者的一條重要治則。附麻平喘方根據這一治則合理組方，該方由補腎、調肺等中藥組成:附子、淫羊藿、巴戟天溫補腎陽為君藥;麻黃、桂枝、蘇子、細辛、紫菀、溫肺宣肺，通降肺氣，為臣藥;熟地黃陰中求陽，決明子瀉中求補，青皮疏肝理氣、調暢氣機，同為佐藥;甘草、白芍引經、調和為使藥。上述君藥不僅能補益正氣，還有一定抗過敏作用[14]。

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