充血性心力衰竭患者血清抗碳酸酐酶Ⅱ和Ⅲ自身抗體檢測的意義

劉辰庚， 夏 鳴， 王金玲， 李 蕾， 王培昌

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院檢驗科，北京 100053;2.閔行區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，上海 201100)

累積的研究表明，自身抗體不僅出現(xiàn)在傳統(tǒng)意義上的自身免疫病患者體內(nèi)，也可見于心臟疾病、糖尿病等多種類型的疾病［1-2］。有研究認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)蛋白的漏出可能是其自身抗體產(chǎn)生的原因之一［2］。我們前期研究結(jié)果表明，缺氧狀態(tài)下培養(yǎng)的心肌細(xì)胞其碳酸酐酶漏出量升高［3］，本研究擬利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(anzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)對在近3個月～1年內(nèi)曾發(fā)生心肌梗死的充血性心力衰竭(congestive heart failure，CHF)患者血清中的抗碳酸酐酶Ⅱ和Ⅲ自身抗體、超氧化物歧化酶(super-oxide dismutase，SOD)等5種抗氧化物水平，白細(xì)胞介素2(inter-leukin 2，IL-2)等5種細(xì)胞因子的水平以及紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)進(jìn)行檢測和臨床意義的初步評價。

材料和方法

一、臨床資料

收集宣武醫(yī)院2011年5月至2012年6月的CHF患者共58例(符合世界衛(wèi)生組織 /國際心臟病學(xué)會診斷標(biāo)準(zhǔn))，其中男39例，女19例，平均年齡(65.8±7.6)歲。另隨機(jī)選取58名健康受試者為對照組，其中男39名，女19名，平均年齡(66.3±8.1)歲。受試者于上午空腹分別使用促凝采血管和ESR管空腹抽取靜脈血，抽血后立即進(jìn)行ESR檢測，促凝采血管中的標(biāo)本經(jīng)分離后將血清保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

二、抗碳酸酐酶Ⅱ和Ⅲ自身抗體ELISA檢測

稀釋碳酸酐酶 Ⅱ和Ⅲ(Sigma)至5μg/mL;包被的酶標(biāo)板用保鮮膜封好，置4℃過夜;使用洗滌液緩沖液清洗5次，每孔加入封阻液，于室溫下放置30 min，洗板3次;每孔加入100μL稀釋后的血清標(biāo)本(碳酸酐酶Ⅱ測定為1∶150稀釋，碳酸酐酶Ⅲ測定為1∶100稀釋)，37℃放置30 min，洗板3次;每孔加入封閉緩沖液稀釋的二抗100μL(Santa cruz)，37℃放置30 min;每孔加入100μL底物緩沖溶液(KPL)，37℃避光反應(yīng)30 min;每孔加入25μL終止液(KPL)，讀取波長450 nm 處(參考波長630 nm)吸光度(A)值［4］。

三、其他指標(biāo)的測定

SOD使用英國朗道公司的試劑在日立7600生化分析儀上進(jìn)行測定，測定前先進(jìn)行定標(biāo)和質(zhì)控操作。過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，TAC)、丙二醛(methanedicarboxylic aldehyde，MDA)使用 BioVision公司試劑，IL-2、白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)、白細(xì)胞介素17(interleukin17，IL-17)、腫瘤壞死因子 α(tumor nerosis factor-aplha，TNF-α)和γ 干擾素(interferon-garmma，IFN-γ)使用 R＆D 公司ELISA試劑。以上檢測項目均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗和直線相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

CHF患者血清抗碳酸酐酶Ⅱ自身抗體水平顯著高于對照組(P＜0.05)，抗碳酸酐酶Ⅲ自身抗體水平與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1;CHF患者ESR水平顯著高于對照組(P＜0.05)，但CHF患者ESR檢測結(jié)果與血清抗碳酸酐酶Ⅱ自身抗體水平不具有相關(guān)性(r=0.39，P＞ 0.05);CHF 患者的 SOD、GPx、CAT和TAC水平顯著低于對照組(P＜0.05)，MDA水平高于對照組(P＜0.05)，見表2;CHF患者血清的IL-2和IL-17水平較對照組顯著升高(P＜0.05)，IL-6、TNF-α和IFN-γ水平與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表3。

表1 CHF患者和對照組抗碳酸酐酶Ⅱ和Ⅲ自身抗體及ESR水平比較(±s)

表1 CHF患者和對照組抗碳酸酐酶Ⅱ和Ⅲ自身抗體及ESR水平比較(±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05

組別 碳酸酐酶Ⅱ抗體(A)碳酸酐酶Ⅲ抗體(A)ESR(mm/h)對照組0.041±0.02 0.035±0.01 15±5 CHF 組 0.135±0.06* 0.052±0.02 23±8*

表2 CHF患者和對照組抗氧化物活性及MDA水平比較(±s)

表2 CHF患者和對照組抗氧化物活性及MDA水平比較(±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05

CHF 組 123.8±21.9* 139.3±41.1* 1.1±0.3* 12.3±3.3* 4.7±1.1*

表3 CHF患者和對照組細(xì)胞因子水平比較(±s，ng/L)

表3 CHF患者和對照組細(xì)胞因子水平比較(±s，ng/L)

注:與對照組比較，*P＜0.05

CHF 組 3.34±1.35* 1.51±0.49 2.98±0.73*14.02±3.31 12.17±4.73

討 論

碳酸酐酶(EC 4.2.1.1)是一族含鋅的金屬蛋白酶，也是最重要的含鋅金屬酶之一，其主要功能是催化二氧化碳的水合和碳酸的水解，對二氧化碳的運輸、水電解質(zhì)和酸堿平衡調(diào)節(jié)以及細(xì)胞內(nèi)、外電勢差的形成有重要作用。目前至少已經(jīng)發(fā)現(xiàn)15種不同類型的碳酸酐酶同工酶，其中碳酸酐酶Ⅲ和Ⅳ的活性相對較強(qiáng)［5］。他們廣泛分布于人體多種組織器官中，與青光眼、骨質(zhì)疏松癥、癌癥等多種病理生理過程密切相關(guān)。碳酸酐酶Ⅱ在腦組織、腎臟和肌肉組織中含量較高，碳酸酐酶Ⅲ主要存在于脂肪組織、肝臟、心肌和慢骨骼肌纖維中。碳酸酐酶Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ自身抗體已經(jīng)分別在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和1型糖尿病患者體內(nèi)中被檢測到［6-7］。目前至少已發(fā)現(xiàn)了17種與心肌組織相關(guān)的自身抗體，包括鈉泵、鈣泵等與心肌細(xì)胞功能密切相關(guān)功能蛋白的自身抗體［2］。有學(xué)者認(rèn)為自身抗原長期緩慢暴露是其自身抗體產(chǎn)生的原因之一［1-2］。免疫反應(yīng)和免疫抑制的平衡受多種因素的影響和控制，其中抗氧化活性和細(xì)胞因子的改變起到了很大的作用，雖然目前尚無實驗證明這些心肌細(xì)胞相關(guān)自身抗體是否能造成相關(guān)功能蛋白質(zhì)的功能障礙或影響心肌細(xì)胞的正常生理活動，但自身抗體的出現(xiàn)至少標(biāo)志著免疫反應(yīng)和免疫抑制的平衡被打破［8］。本課題組的前期研究表明，缺氧狀態(tài)下的心肌細(xì)胞會漏出大量的碳酸酐酶Ⅳ到培養(yǎng)基中，從而導(dǎo)致培養(yǎng)基中的碳酸酐酶Ⅳ水平顯著升高［3］，而人體內(nèi)各項抗氧化能力指標(biāo)的異常可能參與誘導(dǎo)了自身抗體的產(chǎn)生［7］。碳酸酐酶Ⅱ與Ⅳ具有相似的相對分子質(zhì)量和空間構(gòu)象，故在同樣的心肌細(xì)胞損傷情況下，碳酸酐酶Ⅱ和Ⅲ的漏出比例應(yīng)該與碳酸酐酶Ⅳ相當(dāng)。由此我們推測，CHF患者碳酸酐酶Ⅱ的長期暴露可能是其自身抗體產(chǎn)生的原因。有研究表明，碳酸酐酶可以減輕氧化應(yīng)激給機(jī)體帶來的損傷，同時其具有的酪氨酸磷酸酶活性對心肌細(xì)胞離子通道的活性也具有調(diào)節(jié)作用［9］。有研究表明，碳酸酐酶自身抗體能夠有效地抑制碳酸酐酶的總活性［4］，故CHF患者血清碳酸酐酶Ⅱ自身抗體如能通過吞噬小泡進(jìn)入心肌細(xì)胞內(nèi)部，也可能對心肌細(xì)胞的正常生理功能產(chǎn)生影響。雖然不能僅由一種或幾種自身抗體的檢出而把某種疾病劃歸為自身免疫病，但自身抗體的產(chǎn)生和滴度的變化可以作為疾病活動性的監(jiān)測和風(fēng)險預(yù)測的指標(biāo)，應(yīng)對其進(jìn)行深入研究［10］。本研究表明，ESR水平與抗碳酸酐酶Ⅱ和Ⅳ自身抗體滴度之間無相關(guān)性，目前已有多位學(xué)者進(jìn)行了ESR測定與不同種類自身抗體之間相關(guān)性的研究［11-12］，雖然其相關(guān)系數(shù)大都未超過 0.85，但ESR測定值的高、低能反應(yīng)自身抗體水平的變化已經(jīng)得到了越來越多的證實，值得研究者投入更多的精力。

細(xì)胞因子的改變與自身免疫反應(yīng)的水平和強(qiáng)度也存在聯(lián)系，本研究結(jié)果表明 CHF患者的IL-6、IFN-α和 IFN-γ 水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但I(xiàn)L-2和IL-17水平顯著升高，這與之前一些研究的結(jié)果略有不同，其原因可能與本研究入組人群的平均年齡較低，從而因年齡自然增加所導(dǎo)致的自身免疫反應(yīng)較弱有關(guān)［7，13］。抗炎細(xì)胞因子和促炎細(xì)胞因子的平衡是維持人體內(nèi)正常免疫反應(yīng)的前提之一［14］，IL-2和IFN-α為同時具有抗炎和促炎作用的細(xì)胞因子，故CHF患者血清IL-2水平的升高對抗碳酸酐酶Ⅳ自身抗體的產(chǎn)生究竟起到何種作用還需進(jìn)一步的證實。

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