2011至2013年仁濟醫院神經外科病房分離的鮑曼不動桿菌的耐藥性變遷與同源性分析

陳藝升， 應春妹， 李永麗

(上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院檢驗科，上海200127)

鮑曼不動桿菌是一種臨床常見的革蘭陰性非發酵菌，是引起院內感染的主要條件致病菌之一。近年來，鮑曼不動桿菌分離率不斷增加，尤其是耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(carbapenems resistant Acinetobacter baumannii)，且此類菌株往往同時對β-內酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類等抗菌藥物耐藥，給臨床治療帶來極大困難。此外，耐藥株極易爆發流行，尤其是在神經外科和重癥監護病房［1］。為了解仁濟醫院神經外科病房鮑曼不動桿菌耐藥性變遷和分子流行特征，本研究收集2011年7月至2013年6月神經外科病房臨床分離的鮑曼不動桿菌共87株，采用瓊脂稀釋法檢測其對臨床常用抗菌藥物的敏感性，多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)技術對其進行基因型別分析，了解神經外科近年來分離的鮑曼不動桿菌耐藥性變遷和主要基因型別，為指導臨床用藥和控制醫院感染提供依據。

材料和方法

一、材料

1.菌株 收集仁濟醫院2011年7月至2013年6月神經外科分離的鮑曼不動桿菌共87株，剔除同一患者重復標本。所有菌株均采用西門子Micro Scan WalkAway 96 plus細菌鑒定儀鑒定。質控菌株為大腸埃希菌(ATCC 25922)和銅綠假單胞菌(ATCC 27853)。

2.儀器與試劑 Micro Scan WalkAway 96 plus細菌鑒定儀(西門子公司，德國);veriti 96孔梯度聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)儀(ABI，美國);瓊脂糖凝膠電泳儀(Biorad);凝膠成像系統(上海天能技術有限公司);哌拉西林、他唑巴坦、頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢噻肟、美羅培南、慶大霉素、阿米卡星、米諾環素、環丙沙星、磺胺甲口惡唑、甲氧芐啶等抗菌藥物購自上海科佳藥檢器材公司;頭孢肶肟由上海施貴寶制藥有限公司惠贈;亞胺培南由杭州默沙東制藥有限公司惠贈。

二、方法

1.體外藥物敏感性試驗 采用瓊脂稀釋法檢測87株鮑曼不動桿菌對12種抗菌藥物的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，結果判讀參照美國臨床實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2012年標準［2］。

2.MLST 從血平板上挑取單個菌落于300μL 0.85%的生理鹽水中，制成細菌懸液，以8 600×g離心5 min，棄上清液，加入300μL無菌雙蒸水重懸細菌，100℃水浴15 min，12 000×g離心5 min，取上清液即為DNA模板。參照鮑曼不動桿菌 MLST數據庫(http://pubmlst.org/abaumannii/)設計 gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi和 rpoD 7個管家基因［3］引物序列，見表1，由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。PCR總反應體系為25μL，其中 10×PCR緩沖液(含MgCl2)2.5 μL，dNTP(各 2.5 mmol/L)2 μL，上、下游引物 (10 μmol/L)各 0.5 μL，Taq 酶0.25 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 18.25 μL。反應條件:94℃預變性5 min;94℃變性30 s、52～56℃退火45 s、72℃延伸1 min，共30個循環;最后72℃延伸7 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定單一條帶后，送英濰捷基(上海)貿易有限公司進行雙向測序。

表1 PCR引物序列和產物長度

結 果

一、藥物敏感性試驗

87株鮑曼不動桿菌對12種抗菌藥物普遍耐藥，對米諾環素的耐藥率最低，為32.2%，對其它抗菌藥物的耐藥率均在70%以上;對磺胺甲口惡唑-甲氧芐啶耐藥，見表2。耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌67株，占77.0%。比較連續3年神經外科鮑曼不動桿菌耐藥率變遷發現，除米諾環素耐藥率略有降低外，對其余抗菌藥物的耐藥率均有上升趨勢。

二、MLST

87株鮑曼不動桿菌可分為6個ST型，其中ST-208型 45株，占 51.7%;ST-191型 15株，占17.2%;ST-540型8株;ST-195型和ST-381型各2株;ST-368型1株;余下14株都至少有一個新的等位基因，無法鑒定ST型。除ST-381外，其余5種型別均屬于CC92克隆群，具有基因同源性。ST-208型是仁濟醫院神經外科鮑曼不動桿菌的主要克隆流行株。綜合87株鮑曼不動桿菌的MIC結果發現，ST-208型和ST-191型是耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的主要流行型別，是造成神經外科耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌分離率高的重要原因。見表3。

表2 87株鮑曼不動桿菌對12種抗菌藥物的耐藥率

表3 ST基因型數量及構成比 ［株(%)］

討 論

鮑曼不動桿菌是一種重要的醫院感染條件致病菌，常引起肺炎、菌血癥、尿路感染、繼發性腦膜炎、手術部位感染等［4］。碳青霉烯類藥物(如亞胺培南和美羅培南)是治療鮑曼不動桿菌感染的首選藥物，但是隨著抗菌藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的分離率和耐藥率均呈現上升趨勢，使臨床治療和醫院感染控制面臨嚴峻挑戰。2011年上海地區細菌耐藥性監測結果顯示鮑曼不動桿菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為53%和55%［5］，同年中國CHINET細菌耐藥性監測結果顯示對兩者的耐藥率為60.4%和61.4%［6］。

神經外科患者多存在較嚴重的基礎疾病，感染鮑曼不動桿菌的耐藥性也相對較高。本研究中分離的87株鮑曼不動桿菌對12種抗菌藥物普遍耐藥，對米諾環素的耐藥率稍低，為32.2%，對其他抗菌藥物的耐藥率均在70.0%以上。87株鮑曼不動桿菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率高達74.7%和80.5%，其中耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌67株，占77.0%。進一步分析發現耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌往往同時對β-內酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類等藥物高度耐藥。連續3年鮑曼不動桿菌耐藥性變遷顯示，除米諾環素外，對其它抗菌藥物的耐藥率均有逐年增加趨勢。以亞胺培南為例，2011年的耐藥率僅為59.3%，2012年上升至78.0%，而2013上半年的耐藥率已高達89.5%。

耐藥鮑曼不動桿菌極易造成醫院感染流行，Bernards、Clímaco 等［7-8］均報道有鮑曼不動桿菌的院內流行，對菌株進行基因分型，分析不同型別之間的同源關系，有利于了解菌株流行特征，能夠及時發現菌株爆發流行并采取控制措施。MLST技術是國際公認的型別鑒定方法，該法操作簡便，可追溯菌株的同源性和傳播性，且鑒定結果可用于不同實驗室之間的比較。Huang等［9］對國內某家醫院連續6年分離的耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌進行MLST分型，發現存在CC92克隆株流行傳播。Gurung等［10］近期的研究結果也發現院內ST-191型碳青霉烯類耐藥株的播散。He等［11］的研究證實鮑曼不動桿菌CC92克隆群已在全國范圍內流行。本研究中的87株鮑曼不動桿菌可分為6個 ST基因型，其中 ST-208型 45株(51.7%)，是神經外科的主要流行型別，其次是ST-191型(17.2%)。除 ST-381以外，其余5種型別均屬于CC92克隆群，具有基因同源性。比較3年內神經外科鮑曼不動桿菌流行型別可知，ST-208一直是仁濟醫院神經外科最主要的流行型別，而ST-191型從2011年的3.7%上升到2012年的29.3%(12/41)，且在2013年也占有一定的比例，是一種新的流行株。結合MIC結果，67株碳青霉烯類耐藥株中ST-208型(37株)和ST-191型(13株)占了64.1%，所以ST-208型和ST-191型的流行傳播是導致仁濟醫院神經外科耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌分離率高的重要原因。

本研究結果表明，仁濟醫院神經外科鮑曼不動桿菌耐藥性嚴峻，耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌分離率高，且存在耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌克隆株傳播。鑒于臨床對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌尚缺乏良好的治療方案，需加強耐藥性監測及合理使用抗菌藥物，提高醫護人員消毒意識，避免此類菌株爆發流行。

［1］Fu Y，Zhou J，Zhou H，etal.Wide dissemination of OXA-23-producing carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii clonal complex 22 in multiple cities of China［J］.J Antimicrob Chemother，2010，65(4):644-650.

［2］Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing:twenty-first informational supplement［S］.M100-S22，CLSI，2012.

［3］蘇運欽，葉聰秀，車玉傳，等.多位點序列分型技術在鮑曼不動桿菌同源性分析中的應用［J］.中國抗生素雜志，2013，38(5):360-362.

［4］Peleg AY，Seifert H，Paterson DL，etal.Acinetobacter baumannii:emergence of a successful pathogen［J］.Clin Microbiol Rev，2008，21(3):538-582.

［5］朱德妹，楊 洋，蔣曉飛，等.2011年上海地區細菌耐藥性監測［J］.中國感染與化療雜志，2012，12(6):401-411.

［6］胡付品，朱德妹，汪 復，等.2011年中國CHINET細菌耐藥性監測［J］.中國感染與化療雜志，2012，12(5):321-329.

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［10］Gurung M，Rho JS，Lee YC，etal.Emergence and spread of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii sequence type 191 in a Korean hospital［J］.Infect Genet Evol，2013，19:219-222.

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