三氧化二砷對腸癌HCT116細胞Smads表達的影響

馮 越 蔡士昌 蔡朋朋 李雪松 孫智睿 費洪新 徐廣有

1.齊齊哈爾醫學院 2009級學生，黑龍江齊齊哈爾 161000；2.齊齊哈爾醫學院附屬三院消化科，黑龍江齊齊哈爾 161000；3.齊齊哈爾醫學院附屬三院心內科，黑龍江齊齊哈爾 161000；4.齊齊哈爾醫學院組胚室，黑龍江齊齊哈爾 161000；5.齊齊哈爾醫學院微形態實驗室，黑龍江齊齊哈爾 161000

大腸癌是消化系統常見的腫瘤，已躍居成為惡性腫瘤死因的第4位[1]。大腸癌的發生發展是多因素、多階段、多步驟的過程，涉及一系列調控基因和因子的變化，其中TGF-β/Smads信號傳導通路是控制細胞增殖和誘導凋亡的重要通路，在腫瘤的發生，發展過程中具有重要的作用。三氧化二砷(As2O3)的抗腫瘤效果已得到多數學者肯定[2-4]，As2O3主要是通過抑制細胞增值，誘導細胞分化和凋亡起到抗腫瘤的目的，三氧化二砷對體外腸癌細胞的作用，國內研究較少，先期研究已經表明As2O3對腸癌HCT116細胞具有明顯抑制作用，且隨濃度增加而增強，本研究繼續將三氧化二砷作用于腸癌HCT116細胞，應用免疫熒光化學術，Western blotting觀察 TGF-β/Smads信號通路中重要基因Smad3、Smad7在人低分化結腸腺癌細胞株HCT-116中的表達，及AS2O3干預前后的變化情況，闡述TGF-β/Smads信號通路中Smads相關分子在腸癌HCT116細胞中有關分子的變化規律，探討腸癌發生的病理機制和分析As2O3作用新靶點，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

As2O3購自哈爾濱伊達藥業，人腸癌細胞HCT116由中科院上海細胞庫提供，CO2培養箱購自日本SANYO公司，OLYMPUS倒置顯微鏡由奧地利生產，Smads抗體購于博奧森公司，其余二抗等購于武漢博士得公司。

1.2 細胞培養

復蘇后的HCT116細胞接種于培養瓶中,加入1640培養液(含熱滅活胎牛血清,2 g/LNaHCO3,青霉素和鏈霉素各100 mg/L)中，置于恒溫培養箱中培養(條件為37℃，5%CO2濃度及飽和濕度)，然后用0.15%胰蛋白酶消化傳代,取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 分組及藥物處理

將5×104個/mL單細胞懸液接種在96孔培養板中，其中空白對照組加10%的培養液,用于試驗的低劑量組加入0.5μmol/L濃度的As2O3，中劑量組加1.5μmol/L As2O3，高劑量組加2.5μmol/L的As2O3液,在培養72 h后取出細胞用于實驗。

1.4 間接免疫熒光術檢測Smad3、Smad7蛋白的表達

收集對數生長期的HCT-116細胞,用0.15%胰酶消化成單細胞懸液后,以1×105/mL細胞濃度接種在放有玻片的24孔培養板中,1 mL/孔，37℃,5%CO2孵箱中培養72 h,待細胞貼壁后,棄去上清液,換成無血清的培養液，繼續培養48 h后，吸盡上清液，PBS洗5 min×3次，取出玻片，中性樹膠封片（有細胞面向上），過夜晾干，4℃保存備用，間接免疫熒光術檢測，按試劑盒說明書進行操作（Smad 蛋白抗體濃度為 1∶100,熒光抗體濃度為 1∶50），用熒光顯微鏡觀察，結果以熒光強度表示。

1.5 westernblotting檢測Smads相關蛋白表達

將上述各組As2O3處理過的培養細胞,用PBS進行漂洗，裂解細胞,離心然后灌凝膠上樣，將蛋白樣品加入50μg/孔電泳分離，轉至PVDF膜然后上搖床后用TBS封閉抗原1 h，加入一抗（Smad3、Smad7）,4℃過夜，TBS洗膜后加入二抗稀釋液(用封閉液進行稀釋，稀釋濃度為1∶2000)室溫孵育膜lh，TBS洗膜3次，βactin為參照，拍照。

1.6 統計方法

采用SPSS 12.0軟件對數據進行統計分析,計量資料用均數±標準差()表示，比較用 t檢驗。

2 結果

2.1 免疫熒光化學術檢測Smad3,Smad7蛋白表達

見表1。

表1 As2O3作用下HCT116細胞Smads蛋白熒光強度值()

表1 As2O3作用下HCT116細胞Smads蛋白熒光強度值()

注：與對照組比較，*P<0.05。

名稱Smad3 Smad7空白對照組0.5μmol/L As2O3 組 *1.5μmol/L As2O3 組 *2.5μmol/L As2O3 組 *16.61±0.6419.94±1.5734.17±1.2839.64±1.6338.61±0.6431.53±0.6721.69±0.9420.04±0.31

2.2 Westernblotting檢測Smads相關基因

Smad3蛋白：對照組，及各濃度As2O3組相比較，Smad3蛋白表達逐漸增高，說明隨著腫瘤細胞抑制作用的增加，Smad3表達增多，調控其下游信號的傳導。見圖2。

圖2 對照，0.5μmol/L，1.5μmol/L，2.5μmol/L As2O3，β-actin

Smad7蛋白的表達：對照組，以及各濃度As2O3相比，Smad7蛋白表達逐漸減少，表明隨As2O3濃度的增加，腫瘤細胞的受到抑制的作用增強，Smad7表達減少，減弱了對TGF-β/Smads信號通路的負反饋調節作用。見圖3。

圖3 對照，0.5μmol/L，1.5μmol/L，2.5μmol/L As2O3，β-actin

3 討論

研究顯示,與腫瘤發生高度相關的TGF-β/Smads信號通路由TGF-β超家族及其受體,Smads蛋白及其調節基因組成。TGF-β/Smads通路在腫瘤發生發展過程中會出現表達的異常，而使腫瘤細胞生物學行為改變[5]。目前比較清楚的是，在腫瘤發展的早期，TGF-β1能夠抑制腫瘤細胞增殖，使細胞停留在G1期，誘導細胞凋亡，但在腫瘤晚期，該信號通路中的一些因子發生突變，使腫瘤細胞能夠逃逸TGF-β1的抑制作用而發生增殖，這可能與TGF-β1下游的Smads分子表達異常有關，所以TGF-β/Smads通路在腫瘤中變化比較復雜。本研究中發現對照組Smad3為16.61±0.64，且隨著三氧化二砷作用濃度的增加表達逐漸增加，當 As2O3 為 2.5μmol/L 時，Smad3 達到（39.64±1.63），各濃度三氧化二砷作用下的Smad3表達，相比正常對照組，均差異有統計學意義（P<0.05）。實驗表明在體外培養的腸癌細胞HCT116中，隨著腫瘤細胞數目的減少和細胞活動相對靜止期時，Smad3表達逐漸增多，提示Smad3在腫瘤早期或相對穩定時表達較高。已有研究表明，缺乏Smad3的小鼠在幽門螺桿菌感染和炎癥反應下更易發生結直腸癌[6]，上述研究說明在腫瘤發展過程中，Smad3可能具有抑制腫瘤的作用，其中TGF-β1在腫瘤發展的早期具有抑制腫瘤發展的作用，也可能是通過Smad3的表達來實現的。在整個Smad信號通路中，除了上述調節型Smad 1，2，3等，還包括抑制型Smad 6、7，它們不直接參與信號的傳遞但對整個通路具有負調控作用。Smad7位于染色體18q21上,該位點等位基因的丟失見于多種惡性疾病,并且與死亡率高,易發生轉移有關。Smad7對TGF-B家族的信號傳遞中起負反饋調節作用,Smad7表達的紊亂，可影響細胞對 TGF-β的應答,從而促進細胞的惡性進展。Nakagawa在體外實驗中發現Smad7在胰腺癌中有較高的表達,將Smad7基因轉染至胰腺癌細胞，會使其惡性度增高,裸鼠動物模型發生腫瘤機會增加,提示 Smad7表達增高有可能促進腫瘤的發生[7]。同時Gulubova等[8]在142例結直腸癌患者中,110例腫瘤標本(77.4%)中抑制性蛋白 Smad7陽性表達,119例患者(76.3%)腫瘤細胞膜上TGF-R表達陽性。該研究中，對照組Smad7 陽性表達 (38.61±0.64，2.5)μmol/L As2O3 組則為 (20.04±0.31)，即隨著三氧化二砷對腫瘤細胞抑制作用的增強，Smad7表達逐漸減少，各濃度三氧化二砷用藥組和對照組比較，P<0.05，差異有統計學意義，這與上述研究結果類似。在該研究中可能是三氧化二砷使腫瘤細胞表達Smad7減少，進而減弱了對TGF的反饋抑制作用，從而使TGF對其下游的Smad2,3等調控發揮作用，說明Smad7表達的異常是腸癌的重要分子特征。

該研究中Smad3、Smad7表達在4組中均差異有統計學意義,提示兩者均參與結腸癌的發生、發展過程，Smad3、Smad7表達的異常很可能成為結腸癌重要的分子特征，這還待于統計學上的篩選和確認，上述研究表明TGF-β/Smads信號通路可能是三氧化二砷發揮作用的重要靶點之一，上述基因只是腫瘤細胞增殖和凋亡等眾多調控基因網絡中的一員，Smads與胞外信號調節激酶(MAPK)通路、核轉錄因子-κB(NF-κB)等相互作用[9-11]，其間的更詳細的因果關系以及機制有待進一步研究。

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