山刺玫果提取物的質量標準

摘要：建立山刺玫果提取物的定性鑒別和含量測定方法，采用薄層色譜法對山刺玫果提取物進行定性分析；采用紫外-可見分光光度法建立山刺玫果提取物總黃酮的含量測定方法；采用高效液相色譜法建立山刺玫果提取物中槲皮素的含量測定方法，其中色譜柱為伊利特C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-水-磷酸-三乙胺（50 ∶50 ∶0.45 ∶0.2），流速為1 mL/min，進樣量為20 μL，檢測波長374 nm，柱溫30 ℃。建立的薄層色譜鑒別方法熒光斑點清晰，陰性無干擾；蕓香苷在3.70～44.40 μg/mL（r=0.999 7）、槲皮素在0.02～0.20 μg（r=0.999 9）內線性關系良好；蕓香苷平均回收率為101.32%，RSD為1.67%（n=9），槲皮素平均回收率99.80%，RSD為1.31%（n=9）。建立的薄層鑒別方法專屬性高，含量測定方法具有良好的精密度，結果準確可靠，可用于山刺玫果提取物的質量控制。

關鍵詞：山刺玫果；金絲桃苷；總黃酮；槲皮素

中圖分類號： R284.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0248-03

收稿日期：2013-11-29

基金項目：吉林省科技計劃（編號：20110948）。

作者簡介：楊揚（1989—），女，吉林吉林人，碩士研究生，主要從事天然產物有效成分的提取及純化工藝研究。E-mail：15643957455@163.com。

通信作者：鐘方麗，博士，教授，主要從事天然產物的研究與開發。E-mail：fanglizhong@sina.com。山刺玫果別稱野薔薇、野玫瑰、薔薇果，系薔薇科植物山刺玫（Rosa davurica Pall.）的成熟果實，廣泛分布在我國東北及山西、內蒙等地，花、根、果均可入藥，其果實為卵形或球形，營養豐富、酸甜可口，可抗衰老，治腸炎、食欲不振，防治心血管疾病等，民間大量采食或用于泡酒、泡茶等，《中藥大辭典》認為其有健脾理氣、養血調經的作用。據報道，山山刺玫果內含多種維生素、氨基酸及黃酮類化合物等成分，具有很大的開發價值，山刺玫果作為一種具有保健和治療作用的天然產物被日益重視[1-5]。山刺玫果中所含的總黃酮類物質具有防治高血脂和血栓所致的心腦血管疾病的功效[6-7]，其中蕓香苷具有舒張血管、抗病毒、抗衰老等生物活性[8]；槲皮素具有抗炎、抗氧化、清除體內自由基的作用，對由膠原、ADP或凝血酶引起的血小板聚集及血栓形成也有抑制作用，并有免疫增強功能及鎮痛等作用[9-10]。本研究以蕓香苷為對照品采用紫外-可見分光光度法對山刺玫果提取物總黃酮的含量進行了測定，并采用高效液相色譜法對山刺玫果提取物中的槲皮素量進行了測定。

1材料

1.1試藥

山刺玫果提取物（批號20120810、20120820、20121011、20121022、20121103）為吉林化工學院化學與制藥工程學院藥學系自制。槲皮素對照品（批號：100081-200907），蕓香苷對照品（批號：100080-200707），金絲桃苷對照品（批號：111521-201004），均為含量測定用，購于中國食品藥品檢定研究院。

1.2儀器

TU-1810紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；LC2000高效液相色譜儀（上海天美科學儀器有限公司）；AEG-220電子天平（日本島津）；KQ-250B超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；ZF-20D暗箱式紫外分析儀（上海寶山顧村電光儀器廠）。

1.3試劑

薄層色譜硅膠G、H（青島海洋化工集團公司），甲醇為色譜純，三乙胺為優級純，水為重蒸餾水，醋酸乙酯、甲酸、乙醇等其他化學試劑均為分析純。

2結果與分析

2.1薄層色譜鑒別

2.1.1對照品溶液及供試品溶液的制備精確稱取干燥至恒重的金絲桃苷對照品5.05 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解，定容，作為對照品溶液，備用。稱取干燥至恒重的山刺玫果提取物0.16 g，精確稱定，置于25 mL容量瓶中，加60%乙醇溶解，定容，吸取5 mL于25 mL容量瓶中，60%乙醇定容，作為供試品溶液，備用。

2.1.2陰性對照液的制備稱取干燥至恒重的山刺玫果提取物0.16 g，精確稱定，50 mL蒸餾水分散，將上述分散液經過D-101樹脂柱，流出液重復上柱，至流出液無黃酮顏色反應，收集流出液，水浴上揮干，用適量60%乙醇溶解，即得除去總黃酮的陰性對照液，備用。

2.1.3結果按《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B 薄層色譜法試驗[11-12]，吸取上述金絲桃苷對照品溶液、3批供試品溶液及陰性對照溶液各5 μL，分別點于同一層析硅膠（G）薄層板（市售鋁箔片基）上，以醋酸乙酯-甲酸-水（8 ∶1 ∶1）為展開劑展開，取出，晾干，均勻地噴以5%AlCl3-乙醇溶液，用電吹風吹至無有機溶劑氣味，置于紫外分析儀（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上顯有相同顏色的熒光斑點（圖1）。

2.2總黃酮含量的測定

2.2.1對照品溶液的制備精確稱取干燥至恒重的蕓香苷對照品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加60%乙醇溶解，定容，搖勻，配制成濃度為0.2 mg/mL的對照品溶液，備用。

2.2.2供試品溶液的制備按“2.2.1”節的方法制備。

2.2.3標準曲線的繪制精確吸取蕓香苷對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加5% NaNO2溶液 1.0 mL，搖勻，放置6 min，加10% Al（NO3）3溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加4% NaOH 10.0 mL，再加60%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min。以相應的試劑為空白，按照分光光度法，在505 nm處測定其吸光度，以吸光度為縱坐標、蕓香苷對照品濃度（mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線[13-14]，進行直線回歸，回歸方程為：y=12.831x+0.003 5，r=0.999 7。結果表明蕓香苷在3.70～44.40 μg/mL范圍內呈良好線性關系。endprint

2.2.4儀器精密度試驗吸取對照品溶液2.0 mL于25 mL容量瓶中，按“2.2.3”節的方法顯色，連續測定6次吸光度，RSD為0.18%，結果表明精密度較好。

2.2.5中間精密度試驗吸取對照品溶液2.0 mL于25 mL容量瓶中，按“2.2.3”節的方法顯色，分別在2臺儀器上連續測定6次吸光度，RSD為1.68%、1.05%，中間精密度的RSD為2.07%，結果表明中間精密度較好。

2.2.6穩定性試驗吸取2.0 mL供試品溶液于25 mL容量瓶中，按“2.2.3”節的方法分別于配制后0、1、2、4、6、8、24 h進行顯色，測定吸光度，RSD為0.41%。按“2.2.3”的方法分別在顯色后于0、5、10、15、20、25、30、35、40、60 min測定吸光度，RSD為1.61%，結果表明供試品溶液在24 h穩定性良好，顯色后60 min穩定，滿足測定要求。

2.2.7重復性試驗取同一批號山刺玫果提取物6份，精確稱量，按“2.2.1”節的方法制成供試品溶液，吸取2.0 mL于25 mL容量瓶中，按“2.2.3”節的方法顯色，在505 nm處測定吸光度，RSD為 2.38%，結果表明重復性良好。

2.2.8加樣回收率試驗稱取9份總黃酮含量已知的供試品，精確稱定，每3份中加入3.18、6.34、9.52 mg/mL對照品溶液5.0 mL，按“2.2.1”節的方法制備供試品溶液，按“2.2.3”節的方法顯色測定，結果見表1。

2.2.9樣品含量測定稱取5批供試品，精確稱定，按“2.2.1”節的方法制備供試品溶液，按“2.2.3”節的方法顯色，在505 nm處測定吸光度，結果顯示5批山刺玫果提取物中總黃酮的含量分別為74.67%、73.00%、74.54%、7321%、75.80%。

2.3槲皮素含量測定

2.3.1對照品溶液的制備精確稱取干燥至恒重的槲皮素對照品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.20 mg/mL的槲皮素對照品溶液。

2.3.2供試品溶液的制備精確稱取干燥的山刺玫果提取物0.16 g，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇-25%鹽酸溶液（4 ∶1）30 mL，密塞，稱質量，置于90 ℃水浴中加熱回流1 h，放冷，稱重，用甲醇補充減失的質量，搖勻，過濾，將濾液轉移至50 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度[15-16]，搖勻，吸取5 mL于25 mL容量瓶中，流動相定容，微孔濾膜（0. 45 μm） 過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.3.3色譜條件及適應性試驗色譜柱為伊利特C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-水-磷酸-三乙胺（50 ∶50 ∶0.45 ∶0.2），流速為1.0 mL/min，檢測波長為 374 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL。在此條件下，槲皮素的保留時間為8.7 min，分離度為2.4，理論塔板數為5 100，其HPLC圖如圖2所示。

2.3.4標準曲線的繪制吸取對照品溶液適量，配成濃度分別為1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL的系列對照品溶液，分別進樣20 μL，以槲皮素峰面積積分值y為縱坐標，進樣量x（μg）為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程為：y=3×106x-11 000，r=0.999 9。結果表明，槲皮素的進樣量在0.02～0.20 μg 范圍內呈良好的線性關系。

2.3.5重復性試驗取同一批號山刺玫果提取物6份，按“2.3.1”節中已定的方法制備供試品溶液，各進樣20 μL進行測定，結果顯示槲皮素峰面積的RSD為1.68%，說明該方法具有良好的重復性。

2.3.6儀器精密度試驗稱取20 μg/mL的槲皮素對照品溶液，連續進樣6次，每次進樣20μL，結果顯示槲皮素峰面

積的RSD為0.98%，說明儀器精密度良好。

2.3.7穩定性試驗吸取供試品溶液，在同一色譜條件下，分別于0、1、2、3、4、5、6、7、8 h進樣20 μL，結果顯示槲皮素的峰面積RSD為1.57%，說明供試品溶液在室溫下8 h穩定。

2.3.8加樣回收率試驗稱取9份槲皮素含量已知的供試品，每3份中分別加入0.20 mg/mL槲皮素對照品溶液1.50、1.88、2.25 mL，按“2.3.1”節的方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進行含量測定，結果見表2。

2.3.9樣品含量測定稱取3批樣品，精確稱定，按“2.3.1”節中已定的方法制備供試品溶液，分別進樣20 μL，測定槲皮素峰面積，計算其含量，結果3批樣品中槲皮素的含量分別為0.221%、0.220%、0.224%。3結論與討論

3.1薄層色譜條件的選擇

3.1.1展開劑的選擇分別以醋酸乙酯-甲酸-水（8 ∶1 ∶1、9 ∶1 ∶1、7 ∶1 ∶1、10 ∶1 ∶1、12 ∶1 ∶1、20 ∶1 ∶1）、甲醇-冰醋酸-水（4 ∶1 ∶5）、苯-醋酸乙酯-甲酸（5 ∶4 ∶1，6 ∶4 ∶1）、三氯甲烷-甲醇-水（28 ∶10 ∶1）為展開劑對展開系統進行比較，結果顯示醋酸乙酯-甲酸-水（8 ∶1 ∶1）系統金絲桃苷比移值適中，斑點分離效果好。

3.1.2硅膠板的選擇分別吸取供試品溶液3批、金絲桃苷對照品溶液及陰性對照溶液，分別考察自制硅膠G板（玻璃片基）、自制硅膠H板（玻璃片基）、層析硅膠（G）薄板（鋁箔片基）、層析硅膠（G）薄板（玻璃片基）的展開效果，結果表明層析硅膠（G）薄板（鋁箔片基）展開效果良好，熒光斑點清晰。

3.1.3顯色劑的選擇根據山刺玫果提取物的主要化學成分為黃酮類化合物，顯色時選擇9%FeCl3、5%AlCl3-乙醇溶液為顯色劑進行顯色，結果顯示，5%AlCl3-乙醇溶液為顯色劑，熒光斑點清晰，所以宜以5%AlCl3-乙醇溶液為顯色劑。endprint

3.2 測定槲皮素含量的供試品溶液制備方法的確定

在槲皮素含量測定中，對供試品溶液制備方法進行研究，分別對水解液的用量、水解時間和水解溫度進行探索。

3.2.1水解液用量的選擇取6份干燥的山刺玫果提取物 0.16 g，精確稱定，置于具塞錐形瓶中，分別加入甲醇-25%鹽酸溶液（4 ∶1）10、15、20、25、30、35 mL，密塞，稱質量，分別于50 ℃下進行水解，每次水解時間為0.5 h。放冷，稱重，用甲醇補充減少的質量，搖勻，過濾，將濾液轉移至50 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，吸取5 mL于25 mL容量瓶中，流動相定容，微孔濾膜（0.45 μm） 過濾，取續濾液作為供試品溶液，進樣20 μL，峰面積分別為27 146、28 147、30 009、34 359、34 479、33 380，根據峰面積選擇水解液用量為30 mL。

3.2.2水解時間的選擇取6份干燥的山刺玫果提取物 0.16 g，精確稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇-25%鹽酸溶液（4 ∶1）30 mL，密塞，稱質量，50 ℃進行水解，每次水解時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。按“3.2.1”節中的方法稀釋過濾，取續濾液作為供試品溶液，進樣20 μL，峰面積為31 326、32 636、35 966、46 117、42 897、40 699，根據峰面積選擇水解時間為2.0 h。

3.2.3水解溫度的選擇按“3.2.2”節中的方法稱取提取物加入水解液，分別于50、60、70、80、90、100 ℃下進行水解，每次水解時間為2.0 h。按“3.2.1”節中的方法稀釋過濾，取續濾液作為供試品溶液，進樣20 μL，峰面積分別為49 692、51 232、62 290、63 009、74 759、68 396，根據峰面積選擇水解溫度為90 ℃。

供試品溶液制備方法為：稱取干燥的山刺玫果提取物0.16 g，精確稱定，置于具塞錐形瓶中，加入水解液甲醇-25%鹽酸溶液（4 ∶1）30 mL，90 ℃水解2.0 h。

本試驗分別采用HPLC、UV法對山刺玫果提取物中槲皮素、總黃酮的含量測定進行了相關的探索，并建立了山刺玫果提取物的薄層鑒別方法，本試驗建立的薄層鑒別方法斑點清晰、簡便快捷，建立的含量測定方法專屬性強、操作簡便、線性關系良好，回收率、重現性符合要求，可以更全面地對山刺玫果提取物進行質量控制，為進一步開發山刺玫果提供了理論依據。endprint

3.2 測定槲皮素含量的供試品溶液制備方法的確定

在槲皮素含量測定中，對供試品溶液制備方法進行研究，分別對水解液的用量、水解時間和水解溫度進行探索。

3.2.1水解液用量的選擇取6份干燥的山刺玫果提取物 0.16 g，精確稱定，置于具塞錐形瓶中，分別加入甲醇-25%鹽酸溶液（4 ∶1）10、15、20、25、30、35 mL，密塞，稱質量，分別于50 ℃下進行水解，每次水解時間為0.5 h。放冷，稱重，用甲醇補充減少的質量，搖勻，過濾，將濾液轉移至50 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，吸取5 mL于25 mL容量瓶中，流動相定容，微孔濾膜（0.45 μm） 過濾，取續濾液作為供試品溶液，進樣20 μL，峰面積分別為27 146、28 147、30 009、34 359、34 479、33 380，根據峰面積選擇水解液用量為30 mL。

3.2.2水解時間的選擇取6份干燥的山刺玫果提取物 0.16 g，精確稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇-25%鹽酸溶液（4 ∶1）30 mL，密塞，稱質量，50 ℃進行水解，每次水解時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。按“3.2.1”節中的方法稀釋過濾，取續濾液作為供試品溶液，進樣20 μL，峰面積為31 326、32 636、35 966、46 117、42 897、40 699，根據峰面積選擇水解時間為2.0 h。

3.2.3水解溫度的選擇按“3.2.2”節中的方法稱取提取物加入水解液，分別于50、60、70、80、90、100 ℃下進行水解，每次水解時間為2.0 h。按“3.2.1”節中的方法稀釋過濾，取續濾液作為供試品溶液，進樣20 μL，峰面積分別為49 692、51 232、62 290、63 009、74 759、68 396，根據峰面積選擇水解溫度為90 ℃。

供試品溶液制備方法為：稱取干燥的山刺玫果提取物0.16 g，精確稱定，置于具塞錐形瓶中，加入水解液甲醇-25%鹽酸溶液（4 ∶1）30 mL，90 ℃水解2.0 h。

本試驗分別采用HPLC、UV法對山刺玫果提取物中槲皮素、總黃酮的含量測定進行了相關的探索，并建立了山刺玫果提取物的薄層鑒別方法，本試驗建立的薄層鑒別方法斑點清晰、簡便快捷，建立的含量測定方法專屬性強、操作簡便、線性關系良好，回收率、重現性符合要求，可以更全面地對山刺玫果提取物進行質量控制，為進一步開發山刺玫果提供了理論依據。endprint

3.2 測定槲皮素含量的供試品溶液制備方法的確定

在槲皮素含量測定中，對供試品溶液制備方法進行研究，分別對水解液的用量、水解時間和水解溫度進行探索。

3.2.1水解液用量的選擇取6份干燥的山刺玫果提取物 0.16 g，精確稱定，置于具塞錐形瓶中，分別加入甲醇-25%鹽酸溶液（4 ∶1）10、15、20、25、30、35 mL，密塞，稱質量，分別于50 ℃下進行水解，每次水解時間為0.5 h。放冷，稱重，用甲醇補充減少的質量，搖勻，過濾，將濾液轉移至50 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，吸取5 mL于25 mL容量瓶中，流動相定容，微孔濾膜（0.45 μm） 過濾，取續濾液作為供試品溶液，進樣20 μL，峰面積分別為27 146、28 147、30 009、34 359、34 479、33 380，根據峰面積選擇水解液用量為30 mL。

3.2.2水解時間的選擇取6份干燥的山刺玫果提取物 0.16 g，精確稱定，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇-25%鹽酸溶液（4 ∶1）30 mL，密塞，稱質量，50 ℃進行水解，每次水解時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。按“3.2.1”節中的方法稀釋過濾，取續濾液作為供試品溶液，進樣20 μL，峰面積為31 326、32 636、35 966、46 117、42 897、40 699，根據峰面積選擇水解時間為2.0 h。

3.2.3水解溫度的選擇按“3.2.2”節中的方法稱取提取物加入水解液，分別于50、60、70、80、90、100 ℃下進行水解，每次水解時間為2.0 h。按“3.2.1”節中的方法稀釋過濾，取續濾液作為供試品溶液，進樣20 μL，峰面積分別為49 692、51 232、62 290、63 009、74 759、68 396，根據峰面積選擇水解溫度為90 ℃。

供試品溶液制備方法為：稱取干燥的山刺玫果提取物0.16 g，精確稱定，置于具塞錐形瓶中，加入水解液甲醇-25%鹽酸溶液（4 ∶1）30 mL，90 ℃水解2.0 h。

本試驗分別采用HPLC、UV法對山刺玫果提取物中槲皮素、總黃酮的含量測定進行了相關的探索，并建立了山刺玫果提取物的薄層鑒別方法，本試驗建立的薄層鑒別方法斑點清晰、簡便快捷，建立的含量測定方法專屬性強、操作簡便、線性關系良好，回收率、重現性符合要求，可以更全面地對山刺玫果提取物進行質量控制，為進一步開發山刺玫果提供了理論依據。endprint