不同發(fā)酵溫度對開菲爾產(chǎn)氨基酸及理化性質的影響

摘要：開菲爾中除含有多種益生菌外，在發(fā)酵過程中還可代謝產(chǎn)生多種功能性物質。試驗研究了開菲爾在不同發(fā)酵溫度下游離氨基酸變化、活性益生菌增殖及對乳酸合成水平的影響，結果表明，30 ℃發(fā)酵至終點，pH值為4.60，開菲爾中游離氨基酸水平高達576.2 mg/kg，活菌數(shù)達1.6×1011 CFU/g，乳酸合成量為8.0 g/L，表現(xiàn)出極好的功能性成分產(chǎn)生水平、菌體細胞生長活性和酸化能力。

關鍵詞：開菲爾；氨基酸；發(fā)酵溫度；活菌數(shù)；乳酸

中圖分類號： TS252.42文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0236-03

收稿日期：2013-11-21

基金項目：“十二五”國家科技支撐計劃（編號：2012BAD28B07、2013BAD18B01）。

作者簡介：王豪（1984—），男，上海人，碩士，工程師，主要從事乳品生物技術研究。E-mail：wanghao840818@126.com。發(fā)酵乳是通過乳酸菌等菌種，代謝利用乳中乳糖和蛋白質等成分，產(chǎn)生多種生物活性物質，賦予機體極好的營養(yǎng)價值及益生特效的一種產(chǎn)品[1]。乳酸菌是一類對營養(yǎng)物質選擇較為挑剔的微生物，在多數(shù)情況下此類菌群的生物合成能力有限，需要外源的氨基酸或肽來支持其生長代謝。由于生乳中缺乏此類小分子物質，因此，乳酸菌的生長取決于對酪蛋白的水解能力[2]。酪蛋白是氨基酸的主要來源，其水解與乳酸菌所分泌的蛋白酶密切相關，細胞膜上的蛋白酶是唯一能夠催化酪蛋白降解為低聚肽的關鍵酶，然后，低聚肽才能被轉入膜內，再經(jīng)由內肽酶及氨肽酶等進一步降解。發(fā)酵乳中由乳酸菌代謝釋放積累的氨基酸會顯著影響發(fā)酵乳制品的營養(yǎng)功能，而游離氨基酸的種類及產(chǎn)生水平取決于乳的品類、乳酸菌的組成、發(fā)酵參數(shù)和貯存條件等因素。發(fā)酵乳中氨基酸總量反映蛋白水解及菌體細胞同化之間的平衡關系，例如，保加利亞乳桿菌的蛋白水解活性要強于嗜熱鏈球菌，前者產(chǎn)生的氨基酸為后者同化利用，從而建立了一種菌群共生平衡關系。

開菲爾是一種由混合菌群發(fā)酵制成的乳制品，目前少有文獻報道開菲爾發(fā)酵過程中體系內游離氨基酸的變化。本試驗研究開菲爾菌群在不同發(fā)酵溫度下氨基酸釋放利用、細胞生長及乳酸產(chǎn)生的特性，以揭示開菲爾菌株間的互生關系，從而在未來工業(yè)化生產(chǎn)中可以設計出具有高活菌數(shù)、高含量游離氨基酸的發(fā)酵乳，提升產(chǎn)品的營養(yǎng)價值和益生功效。

1材料與方法

1.1材料與試劑

生鮮牛乳，光明乳品八廠生產(chǎn)；白砂糖，廣西上上糖業(yè)有限公司生產(chǎn)；開菲爾復合發(fā)酵劑，含保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌雙乙酰亞種，丹尼斯克公司生產(chǎn)；氨基酸化學分析試劑包，美國 Waters 公司生產(chǎn)；Pico Taq衍生化試劑盒，美國Waters公司生產(chǎn)；超濾膜，美國Millpore公司生產(chǎn)；MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基，德國Merck公司生產(chǎn)；其他均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2儀器與設備

超凈工作臺，美國Labconco公司生產(chǎn)；厭氧培養(yǎng)箱，英國Ruskinn公司生產(chǎn)；電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設備公司生產(chǎn)；高壓滅菌鍋，日本Hirayama公司生產(chǎn)；高速冷凍離心機，美國BECKMAN COULTER公司生產(chǎn)；HPLC色譜儀，美國 Waters 公司生產(chǎn)；pH計，美國奧立龍公司生產(chǎn)。

1.3試驗方法

1.3.1開菲爾制備生牛乳驗收→凈化→混料（白砂糖，40～45 ℃）→均質（60～65 ℃，19～21MPa）→殺菌（90 ℃，5 min）→冷卻→接種發(fā)酵至pH值4.6±0.02→攪拌破乳→冷卻至16～22 ℃→灌裝封口。

1.3.2氨基酸測定樣品用4%磺基水楊酸沉淀，4 ℃、10 000 g 離心20 min；取上清液，用10 000 NMWL的膜超濾，等分為50 L，采用Pico Taq衍生化試劑盒進行衍生反應，用于HPLC上樣分析；采用氨基酸化學分析試劑包對游離氨基酸的異硫氰酸苯酯衍生物進行定量。色譜分析條件：Pico Taq柱（3.9 mm×30 cm），溫度46 ℃，進樣量10 L（取自 100 L 稀釋的衍生化樣品）；標準品為額外添加了色氨酸和天冬酰胺的H級氨基酸，進樣量為25 pmol。

1.3.3乳酸測定參考Boehringer描述的酶法檢測流程[3]。

1.3.4微生物計數(shù)采用無菌去離子水進行梯度系列稀釋，平行試驗3次。乳球菌及鏈球菌計數(shù)使用M17瓊脂培養(yǎng)基，乳桿菌計數(shù)使用MRS瓊脂培養(yǎng)基，均采用傾注平板法，分別在30、37、42 ℃環(huán)境溫度下培養(yǎng)至形成明顯菌落后進行計數(shù)。活菌計數(shù)以1 g中的菌落集成單位（CFU/g）來表示。

2結果與分析

2.1不同發(fā)酵溫度下開菲爾的活菌數(shù)含量及乳酸合成量

由圖1可見，開菲爾菌群中無論是桿菌還是球菌，在 30 ℃ 培養(yǎng)時前6 h內均呈指數(shù)級態(tài)勢生長，此發(fā)酵溫度處于乳酸乳球菌最適的生長溫度范圍，低于保加利亞乳桿菌和嗜酸乳桿菌的最適生長溫度，促使整個發(fā)酵過程中球菌數(shù)均高于桿菌數(shù)；發(fā)酵17 h后，pH值降至酪蛋白等電點4.61時，球菌數(shù)較桿菌數(shù)高出約1個數(shù)量級，總菌數(shù)達1.6×1011 CFU/g，所合成的乳酸總量達8.0 g/L。在發(fā)酵過程中，雖然球菌和桿菌均表現(xiàn)出很好的細胞生長趨勢及酸化活性，但是均未到達典型的穩(wěn)定期。

2.2不同發(fā)酵溫度下開菲爾的氨基酸產(chǎn)生種類及合成量endprint

摘要：開菲爾中除含有多種益生菌外，在發(fā)酵過程中還可代謝產(chǎn)生多種功能性物質。試驗研究了開菲爾在不同發(fā)酵溫度下游離氨基酸變化、活性益生菌增殖及對乳酸合成水平的影響，結果表明，30 ℃發(fā)酵至終點，pH值為4.60，開菲爾中游離氨基酸水平高達576.2 mg/kg，活菌數(shù)達1.6×1011 CFU/g，乳酸合成量為8.0 g/L，表現(xiàn)出極好的功能性成分產(chǎn)生水平、菌體細胞生長活性和酸化能力。

關鍵詞：開菲爾；氨基酸；發(fā)酵溫度；活菌數(shù)；乳酸

中圖分類號： TS252.42文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0236-03

收稿日期：2013-11-21

基金項目：“十二五”國家科技支撐計劃（編號：2012BAD28B07、2013BAD18B01）。

作者簡介：王豪（1984—），男，上海人，碩士，工程師，主要從事乳品生物技術研究。E-mail：wanghao840818@126.com。發(fā)酵乳是通過乳酸菌等菌種，代謝利用乳中乳糖和蛋白質等成分，產(chǎn)生多種生物活性物質，賦予機體極好的營養(yǎng)價值及益生特效的一種產(chǎn)品[1]。乳酸菌是一類對營養(yǎng)物質選擇較為挑剔的微生物，在多數(shù)情況下此類菌群的生物合成能力有限，需要外源的氨基酸或肽來支持其生長代謝。由于生乳中缺乏此類小分子物質，因此，乳酸菌的生長取決于對酪蛋白的水解能力[2]。酪蛋白是氨基酸的主要來源，其水解與乳酸菌所分泌的蛋白酶密切相關，細胞膜上的蛋白酶是唯一能夠催化酪蛋白降解為低聚肽的關鍵酶，然后，低聚肽才能被轉入膜內，再經(jīng)由內肽酶及氨肽酶等進一步降解。發(fā)酵乳中由乳酸菌代謝釋放積累的氨基酸會顯著影響發(fā)酵乳制品的營養(yǎng)功能，而游離氨基酸的種類及產(chǎn)生水平取決于乳的品類、乳酸菌的組成、發(fā)酵參數(shù)和貯存條件等因素。發(fā)酵乳中氨基酸總量反映蛋白水解及菌體細胞同化之間的平衡關系，例如，保加利亞乳桿菌的蛋白水解活性要強于嗜熱鏈球菌，前者產(chǎn)生的氨基酸為后者同化利用，從而建立了一種菌群共生平衡關系。

開菲爾是一種由混合菌群發(fā)酵制成的乳制品，目前少有文獻報道開菲爾發(fā)酵過程中體系內游離氨基酸的變化。本試驗研究開菲爾菌群在不同發(fā)酵溫度下氨基酸釋放利用、細胞生長及乳酸產(chǎn)生的特性，以揭示開菲爾菌株間的互生關系，從而在未來工業(yè)化生產(chǎn)中可以設計出具有高活菌數(shù)、高含量游離氨基酸的發(fā)酵乳，提升產(chǎn)品的營養(yǎng)價值和益生功效。

1材料與方法

1.1材料與試劑

生鮮牛乳，光明乳品八廠生產(chǎn)；白砂糖，廣西上上糖業(yè)有限公司生產(chǎn)；開菲爾復合發(fā)酵劑，含保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌雙乙酰亞種，丹尼斯克公司生產(chǎn)；氨基酸化學分析試劑包，美國 Waters 公司生產(chǎn)；Pico Taq衍生化試劑盒，美國Waters公司生產(chǎn)；超濾膜，美國Millpore公司生產(chǎn)；MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基，德國Merck公司生產(chǎn)；其他均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2儀器與設備

超凈工作臺，美國Labconco公司生產(chǎn)；厭氧培養(yǎng)箱，英國Ruskinn公司生產(chǎn)；電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設備公司生產(chǎn)；高壓滅菌鍋，日本Hirayama公司生產(chǎn)；高速冷凍離心機，美國BECKMAN COULTER公司生產(chǎn)；HPLC色譜儀，美國 Waters 公司生產(chǎn)；pH計，美國奧立龍公司生產(chǎn)。

1.3試驗方法

1.3.1開菲爾制備生牛乳驗收→凈化→混料（白砂糖，40～45 ℃）→均質（60～65 ℃，19～21MPa）→殺菌（90 ℃，5 min）→冷卻→接種發(fā)酵至pH值4.6±0.02→攪拌破乳→冷卻至16～22 ℃→灌裝封口。

1.3.2氨基酸測定樣品用4%磺基水楊酸沉淀，4 ℃、10 000 g 離心20 min；取上清液，用10 000 NMWL的膜超濾，等分為50 L，采用Pico Taq衍生化試劑盒進行衍生反應，用于HPLC上樣分析；采用氨基酸化學分析試劑包對游離氨基酸的異硫氰酸苯酯衍生物進行定量。色譜分析條件：Pico Taq柱（3.9 mm×30 cm），溫度46 ℃，進樣量10 L（取自 100 L 稀釋的衍生化樣品）；標準品為額外添加了色氨酸和天冬酰胺的H級氨基酸，進樣量為25 pmol。

1.3.3乳酸測定參考Boehringer描述的酶法檢測流程[3]。

1.3.4微生物計數(shù)采用無菌去離子水進行梯度系列稀釋，平行試驗3次。乳球菌及鏈球菌計數(shù)使用M17瓊脂培養(yǎng)基，乳桿菌計數(shù)使用MRS瓊脂培養(yǎng)基，均采用傾注平板法，分別在30、37、42 ℃環(huán)境溫度下培養(yǎng)至形成明顯菌落后進行計數(shù)。活菌計數(shù)以1 g中的菌落集成單位（CFU/g）來表示。

2結果與分析

2.1不同發(fā)酵溫度下開菲爾的活菌數(shù)含量及乳酸合成量

由圖1可見，開菲爾菌群中無論是桿菌還是球菌，在 30 ℃ 培養(yǎng)時前6 h內均呈指數(shù)級態(tài)勢生長，此發(fā)酵溫度處于乳酸乳球菌最適的生長溫度范圍，低于保加利亞乳桿菌和嗜酸乳桿菌的最適生長溫度，促使整個發(fā)酵過程中球菌數(shù)均高于桿菌數(shù)；發(fā)酵17 h后，pH值降至酪蛋白等電點4.61時，球菌數(shù)較桿菌數(shù)高出約1個數(shù)量級，總菌數(shù)達1.6×1011 CFU/g，所合成的乳酸總量達8.0 g/L。在發(fā)酵過程中，雖然球菌和桿菌均表現(xiàn)出很好的細胞生長趨勢及酸化活性，但是均未到達典型的穩(wěn)定期。

2.2不同發(fā)酵溫度下開菲爾的氨基酸產(chǎn)生種類及合成量endprint

摘要：開菲爾中除含有多種益生菌外，在發(fā)酵過程中還可代謝產(chǎn)生多種功能性物質。試驗研究了開菲爾在不同發(fā)酵溫度下游離氨基酸變化、活性益生菌增殖及對乳酸合成水平的影響，結果表明，30 ℃發(fā)酵至終點，pH值為4.60，開菲爾中游離氨基酸水平高達576.2 mg/kg，活菌數(shù)達1.6×1011 CFU/g，乳酸合成量為8.0 g/L，表現(xiàn)出極好的功能性成分產(chǎn)生水平、菌體細胞生長活性和酸化能力。

關鍵詞：開菲爾；氨基酸；發(fā)酵溫度；活菌數(shù)；乳酸

中圖分類號： TS252.42文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0236-03

收稿日期：2013-11-21

基金項目：“十二五”國家科技支撐計劃（編號：2012BAD28B07、2013BAD18B01）。

作者簡介：王豪（1984—），男，上海人，碩士，工程師，主要從事乳品生物技術研究。E-mail：wanghao840818@126.com。發(fā)酵乳是通過乳酸菌等菌種，代謝利用乳中乳糖和蛋白質等成分，產(chǎn)生多種生物活性物質，賦予機體極好的營養(yǎng)價值及益生特效的一種產(chǎn)品[1]。乳酸菌是一類對營養(yǎng)物質選擇較為挑剔的微生物，在多數(shù)情況下此類菌群的生物合成能力有限，需要外源的氨基酸或肽來支持其生長代謝。由于生乳中缺乏此類小分子物質，因此，乳酸菌的生長取決于對酪蛋白的水解能力[2]。酪蛋白是氨基酸的主要來源，其水解與乳酸菌所分泌的蛋白酶密切相關，細胞膜上的蛋白酶是唯一能夠催化酪蛋白降解為低聚肽的關鍵酶，然后，低聚肽才能被轉入膜內，再經(jīng)由內肽酶及氨肽酶等進一步降解。發(fā)酵乳中由乳酸菌代謝釋放積累的氨基酸會顯著影響發(fā)酵乳制品的營養(yǎng)功能，而游離氨基酸的種類及產(chǎn)生水平取決于乳的品類、乳酸菌的組成、發(fā)酵參數(shù)和貯存條件等因素。發(fā)酵乳中氨基酸總量反映蛋白水解及菌體細胞同化之間的平衡關系，例如，保加利亞乳桿菌的蛋白水解活性要強于嗜熱鏈球菌，前者產(chǎn)生的氨基酸為后者同化利用，從而建立了一種菌群共生平衡關系。

開菲爾是一種由混合菌群發(fā)酵制成的乳制品，目前少有文獻報道開菲爾發(fā)酵過程中體系內游離氨基酸的變化。本試驗研究開菲爾菌群在不同發(fā)酵溫度下氨基酸釋放利用、細胞生長及乳酸產(chǎn)生的特性，以揭示開菲爾菌株間的互生關系，從而在未來工業(yè)化生產(chǎn)中可以設計出具有高活菌數(shù)、高含量游離氨基酸的發(fā)酵乳，提升產(chǎn)品的營養(yǎng)價值和益生功效。

1材料與方法

1.1材料與試劑

生鮮牛乳，光明乳品八廠生產(chǎn)；白砂糖，廣西上上糖業(yè)有限公司生產(chǎn)；開菲爾復合發(fā)酵劑，含保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌雙乙酰亞種，丹尼斯克公司生產(chǎn)；氨基酸化學分析試劑包，美國 Waters 公司生產(chǎn)；Pico Taq衍生化試劑盒，美國Waters公司生產(chǎn)；超濾膜，美國Millpore公司生產(chǎn)；MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基，德國Merck公司生產(chǎn)；其他均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2儀器與設備

超凈工作臺，美國Labconco公司生產(chǎn)；厭氧培養(yǎng)箱，英國Ruskinn公司生產(chǎn)；電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設備公司生產(chǎn)；高壓滅菌鍋，日本Hirayama公司生產(chǎn)；高速冷凍離心機，美國BECKMAN COULTER公司生產(chǎn)；HPLC色譜儀，美國 Waters 公司生產(chǎn)；pH計，美國奧立龍公司生產(chǎn)。

1.3試驗方法

1.3.1開菲爾制備生牛乳驗收→凈化→混料（白砂糖，40～45 ℃）→均質（60～65 ℃，19～21MPa）→殺菌（90 ℃，5 min）→冷卻→接種發(fā)酵至pH值4.6±0.02→攪拌破乳→冷卻至16～22 ℃→灌裝封口。

1.3.2氨基酸測定樣品用4%磺基水楊酸沉淀，4 ℃、10 000 g 離心20 min；取上清液，用10 000 NMWL的膜超濾，等分為50 L，采用Pico Taq衍生化試劑盒進行衍生反應，用于HPLC上樣分析；采用氨基酸化學分析試劑包對游離氨基酸的異硫氰酸苯酯衍生物進行定量。色譜分析條件：Pico Taq柱（3.9 mm×30 cm），溫度46 ℃，進樣量10 L（取自 100 L 稀釋的衍生化樣品）；標準品為額外添加了色氨酸和天冬酰胺的H級氨基酸，進樣量為25 pmol。

1.3.3乳酸測定參考Boehringer描述的酶法檢測流程[3]。

1.3.4微生物計數(shù)采用無菌去離子水進行梯度系列稀釋，平行試驗3次。乳球菌及鏈球菌計數(shù)使用M17瓊脂培養(yǎng)基，乳桿菌計數(shù)使用MRS瓊脂培養(yǎng)基，均采用傾注平板法，分別在30、37、42 ℃環(huán)境溫度下培養(yǎng)至形成明顯菌落后進行計數(shù)。活菌計數(shù)以1 g中的菌落集成單位（CFU/g）來表示。

2結果與分析

2.1不同發(fā)酵溫度下開菲爾的活菌數(shù)含量及乳酸合成量

由圖1可見，開菲爾菌群中無論是桿菌還是球菌，在 30 ℃ 培養(yǎng)時前6 h內均呈指數(shù)級態(tài)勢生長，此發(fā)酵溫度處于乳酸乳球菌最適的生長溫度范圍，低于保加利亞乳桿菌和嗜酸乳桿菌的最適生長溫度，促使整個發(fā)酵過程中球菌數(shù)均高于桿菌數(shù)；發(fā)酵17 h后，pH值降至酪蛋白等電點4.61時，球菌數(shù)較桿菌數(shù)高出約1個數(shù)量級，總菌數(shù)達1.6×1011 CFU/g，所合成的乳酸總量達8.0 g/L。在發(fā)酵過程中，雖然球菌和桿菌均表現(xiàn)出很好的細胞生長趨勢及酸化活性，但是均未到達典型的穩(wěn)定期。

2.2不同發(fā)酵溫度下開菲爾的氨基酸產(chǎn)生種類及合成量endprint