塊莖類植物酯酶對有機磷農藥殘留的檢測

趙紅艷，金甫東，李世平，史俊友

（曲靖師范學院 化學化工學院，云南 曲靖 655011）

有機磷農藥（OPS）是一類含有機磷原子的有機酯類化合物，在我國使用最廣泛、用量最大的殺蟲劑。因此，它對環境生物安全和人類健康會產生較大的危害[1]。對于有機磷農藥的快速檢測也成為食品衛生科學領域的研究熱點。目前，絕大多數有機磷農藥殘留快速檢測都是基于膽堿酯酶抑制這一原理[2]。但膽堿脂酶來源于動物體，價格貴，保存較為困難。植物酯酶來源廣、成本低、易保存。近年來已有用植物酯酶檢測有機磷農藥的報道[3-4]。研究所使用的酶源大多以小麥、玉米等種子植物為主，酶源的選擇上有一定的局限。本實驗選擇富含淀粉的塊莖農作物土豆(Solanum tuberosum)、紅薯(Ipomoea batatas)、茨菇(Sagittaria sagittifolia)、芋頭[Colocasia esculenta(L.)Schoot]、蓮藕(Nelumbo nuciferaG.)為原材料來提取植物酯酶，旨在擴大酶源，為酶源的選擇提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料、試劑和儀器

1.1.1 試驗材料土豆、紅薯、茨菇、芋頭、蓮藕均購自菜市場。

1.1.2 試劑和儀器固藍B鹽、乙酸-1-萘酯、1-萘酚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙醇均為分析純；敵敵畏、樂果、殺撲磷、甲胺磷、毒死蜱標準品(農業部環境保護科研檢測所研制）。

TU-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；TGL-16C高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；XMT-DA數顯調節儀（姚奧特儀表有限公司）；CJJ78-1磁力加熱攪拌器；AL204-IC電子天平（梅特勒-托多利儀器有限公司）；PHS-3C精密pH計等。

1.2 方法

1.2.1 酶液的提取酯酶的提取：將原材料（土豆、紅薯、茨菇、芋頭、蓮藕）洗凈去皮稱取適量研細，按料液比以1∶5加入pH6.5的磷酸鹽緩沖溶液于燒杯中混合，在磁力加熱攪拌器上攪拌上30min后，4℃下浸泡16 h，4層紗布過濾，靜置取上清液在5 000 r/min的離心機上離心10min，上清液于4℃下保存，備用。

1.2.2 酶促反應適宜條件該試驗根據前人研究，通過單因素試驗，對酶促反應的最適合波長、最適底物用量、最適pH值、最適反應溫度、最適反應時間、酶液的最佳稀釋倍數進行選擇優化。

1.2.3 總酯酶活力和比活力的測定方法

1.2.3.1 1-萘酚的標準曲線的制作[5]配制1-萘酚無水乙醇標準溶液的系列濃度，加pH6.5磷酸鹽緩沖溶液至3mL，然后加0.5mL固藍B鹽溶液，混合均勻，于30℃恒溫水浴保溫10min。用緩沖液作空白,在532 nm處讀取以上反應液的吸光度。以濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,作圖得標準曲線其斜率為：

（1）式中，K為標準曲線的斜率，Ci為1-萘酚溶液濃度，ODi為反應液在532 nm 處的吸光度(OD)，n為標準曲線的濃度點數。

1.2.3.2 總酯酶活力的測定[6-7]在試管中依次加入各自最適合的乙酸-1-萘酯丙酮溶液用量和0.5mL稀釋后的酶液，1.95mL磷酸鹽緩沖溶液。把試管放入各自最適溫度的恒溫水浴中反應相應最適時間。在其中加入0.5mL固藍B鹽溶液。放入30℃的恒溫水浴中反應10min。在相應波長處測定溶液吸光度。根據1-萘酚標準曲線和測得的吸光度可以得到總酯酶活力的計算式為:

（2）式中，E為每毫升酶液所含的總酯酶活力(U/mL)；D為酶液的稀釋倍數；K為對應pH下1-萘酚的標準曲線的斜率；OD為反應后在相應波長處測得的吸光度；U為酶活力單位，1U定義為在規定條件下每分鐘催化得到1 moL 1-萘酚所需的酶量。

1.2.3.3 比活力的測定[8]蛋白質含量測定：以牛血清蛋白為標準蛋白，制作標準曲線，測定酶液的蛋白含量

2.3.5 對不同農藥敏感性及最低檢測限的測定[9-10]分別配制1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04mg/mL系列質量濃度的有機磷農藥(均折算成純化學物質含量)，按總酯酶活力測試步驟，將1.950mL含有不同質量濃度農藥的緩沖液取代不含農藥的緩沖液，測試不同農藥對植物酯酶的抑制程度，其計算式為：

（4）式中，I為抑制率，E1為無農藥抑制時酶液酯酶活性，E2為某一濃度農藥抑制時酶液酯酶活性。將酯酶對農藥的靈敏度定義為曲線的斜率K＇。將農藥濃度取對數值，并以之為橫坐標對抑制率作圖，得曲線的斜率為：

（5）式中，K'為該酯酶對農藥的靈敏度，Ci為農藥物質的量濃度(mol/L)，Ii為農藥濃度為Ci時的抑制率，n為曲線的測試濃度點數。

根據所使用分光光度計的誤差范圍和國家規定的最大殘留限量(MRL)，以可以檢測到的最小農藥濃度為初定檢測限，在此濃度下與空白反應液定值進行t檢驗(n=6)，確定植物酯酶對各種有機磷及氨基甲酸酯類農藥的最低檢測限[7]。

2 結果與討論

2.1 土豆、紅薯、茨菇、芋頭、蓮藕酯酶檢測有機磷農藥的條件探索

2.1.1 酶促反應最適波長對各反應體系進行波長掃描，得土豆、紅薯、茨菇、芋頭、蓮藕的最大吸收波長分別為534 nm，532 nm，533 nm，532 nm、475 nm，此時的酶活性最高。

2.1.2 酶促反應最適底物乙酸-1-萘酯的用量分別以土豆、紅薯、茨菇、芋頭、蓮藕的酯酶進行酶促反應，當底物用量分別為0.50mL、0.50mL、1.00mL、0.50mL、0.50mL時吸光度值最大，相應酶活性最高。

2.1.3 最適合酶促反應pH值用pH值為3.5-7.0磷酸鹽緩沖液配制酶反應體系。得到土豆、紅薯、茨菇、芋頭、蓮藕的酯酶在pH分別為5.5、6.5、6.5、6.0、6.5 h，酶活性最高。

2.1.4 最適反應溫度將酶促反應體系置于30~60℃的恒溫水浴中反應。實驗證明，土豆、紅薯、茨菇、芋頭、蓮藕酯酶的最佳酶催化反應溫度分別為45℃、40℃、40℃、45℃、40℃。

2.1.5 最適反應時間將酶促反應體系于45℃下水浴恒溫5~40min。得土豆、紅薯、茨菇、芋頭、蓮藕酯酶的酶催化反應最佳時間分別為13min、25min、25min、5min、15min。

2.2 總酯酶活力的比較

植物酯酶水解底物乙酸-1-萘酯生成乙酸和1-萘酚，1-萘酚與固藍B鹽作用生成紫紅色的偶氮化合物。做出1-萘酚含量的標準曲線，根據總酯酶活力的計算公式，即可計算得到植物酯酶的總活力。從圖1可知，土豆、紅薯、茨菇、芋頭、蓮藕的總酯酶活力分別為8.462 3、3.102 2、8.743 7、4.268 0、7.491 0，土豆、茨菇、蓮藕的總酯酶活力相對較高，適宜做酶源。

圖1 總酯酶活力的比較

圖2 酯酶比活力

2.3 比活力的測定

用考馬斯亮藍法測定不同酶源的蛋白含量，得到斜率，由比活力的計算方法，得到各植物酯酶土豆、紅薯、茨菇、芋頭、蓮藕的比活力分別為5.459 3、2.367 7、4.482 3、2.978 2、5.295 3 U/mg，如圖2所示，由圖可知土豆、茨菇、蓮藕的比活力相對較高，適宜做酶源。

2.4 可行性與靈敏度

分析方法的靈敏度，是指方法本身能測得被測成分的最低限量。一般用最小檢出量或最低濃度表示。微量分析方法要求靈敏度越高越好[8]。在本試驗確定的最佳反應條件下測定了5種有機磷農藥殘留，以抑制率對農藥濃度的對數做工作曲線，線性方程及靈敏度見表1~3，由表可知，隨著農藥濃度的增加，抑制率增大，酶活性降低。由于各種農藥的化學結構不同，對同一酯酶的抑制程度不同；不同的植物酯酶所含成分不同，所含淀粉量不同，故同種農藥對不同的酯酶的抑制程度也不盡相同。除甲胺磷對茨菇酯酶酶活性抑制不佳外，其它最小檢出量（LOD）都遠低于國家規定的最大殘留限量(MRL)，完全可以滿足實際檢測的需要。相比敵敵畏、甲胺磷、樂果、毒死蜱，殺撲磷對酶的抑制率最高，靈敏度最好，高達67.622。

表1 土豆酯酶對農藥的敏感性和最低檢出限

表2 茨菇酯酶對農藥的敏感性和最低檢出限

表3 蓮藕酯酶對農藥的敏感性和最低檢出限

3 討 論

本試驗在選材上有較大突破，對淀粉含量高的塊莖類植物酯酶活性進行了初步探討。通過對5種塊莖類植物的總酯酶活力、比活力、農藥敏感性和最低檢測限的進行了探索，通過對比發現土豆、茨菇、蓮藕的總酯酶活力和比活力都比較高。通過對5種有機磷類農藥的敏感性試驗可以得出，土豆、蓮藕和茨菇對農藥敏感性高，最低檢測限(LOD)小于國家規定的MRL值，符合檢測要求，證明其作為農藥殘留檢測用酶源是可行的。

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