復骨方促進糖皮質激素性骨質疏松大鼠骨折愈合作用的研究

朱冰+李敏研(等)

[摘要] 目的 探討中藥復骨方對糖皮質激素性骨質疏松（GIOP）大鼠骨折愈合的促進作用。 方法 將48只SD大鼠隨機分為三組，各16只。前8周實驗中，基礎組僅給予肌內注射生理鹽水1 mg/kg，模型組和治療組肌內注射地塞米松1 mg/kg，1次/d，3次/周，建立GIOP動物模型。第8周末對三組大鼠手術造成單側股骨閉合性骨折，骨折處采用金屬內固定，建立GIOP骨折動物模型。術后第2天開始，基礎組和模型組給予蒸餾水10 mL/kg灌胃，治療組以復骨方藥液灌胃給藥，持續8周。觀察各組股骨骨密度（BMD）變化，影像學觀察骨折愈合情況，比較各組骨組織形態計量學參數和生物力學測量結果。 結果 治療組股骨全長骨BMD高于模型組，差異有統計學意義（t = 11.2532，P < 0.05）。模型組大鼠股骨骨小梁面積百分數（TbAr%）、骨小梁數量（TbN）、平均骨小梁厚度（TbTh）均較基礎組下降，骨小梁分離度（TbSp）較基礎組增高，差異有統計學意義（t = 3.5885、7.4488、9.0512、10.0270，P < 0.05）；治療組TbAr%、TbN、TbTh均高于模型組，TbSp低于模型組，兩組各指標比較差異有統計學意義（t = 2.3329、5.3328、5.9512、10.9590，P < 0.05）。模型組的最大載荷、最大撓度及最大應力均較基礎組降低，差異有統計學意義（t = 3.8944、5.3915、4.4739，P < 0.05）；治療組的最大載荷、最大撓度及最大應力均高于模型組，差異有統計學意義（t = 2.9251、3.7628、6.6926，P < 0.05）。 結論 中藥復骨方可提高GIOP骨折大鼠的BMD，改善骨微結構，提高骨生物力學性能。中藥復骨方對GIOP骨折的愈合有促進作用。

[關鍵詞] 復骨方；骨折；愈合；骨組織形態計量學；生物力學；糖皮質激素性骨質疏松

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）10（a）-0014-05

Effects of Chinese Medicine Fugu Prescription on fracture healing of rats with glucocorticoid-induced osteoporosis

ZHU Bing1 LI Minyan1 LIU Zhihua2 SHI Jingwen3

1.Department of Pharmacy， Panyu District Hexian Memorial Hospital of Guangzhou City， Guangdong Province， Guangzhou 511400， China； 2.Department of Surgery， Panyu District Hexian Memorial Hospital of Guangzhou City， Guangdong Province， Guangzhou 511400， China； 3.Department of Laboratory， Guangdong Pharmaceutical University， Guangdong Province， Guangzhou 510006， China

[Abstract] Objective To observe the effects of Chinese Medicine Fugu Prescription on fracture healing of rats with glucocorticoid-induced osteoporosis （GIOP）. Methods 48 SD rats were randomly divided into 3 groups， with 16 rats in each group. Rats of basic group were received intramuscular injection of 1 mg/kg saline. Rats of other groups given intramuscular injection of Dexamethasone （1 mg/kg， once a day， 3 times a week） for 8 weeks to establish GIOP animal model. In the end of 8th week， all rats were established the bone fracture in the middle of right femora. On the 2nd day of modeling， basic and model group were given distilled water 10 mL/kg by intragastric administration， treatment group was given Chinese Medicine Fugu Prescription， once per day for 8 weeks. Bone mineral density （BMD） was examined by dual-energy X-ray absorptiometry. Rats were sacrificed after fracture 8 weeks， femurs were removed for biomechanics test and morphologic observation. Results The BMD value of mice femora in the treatment group was higher than that in the model group， there was statistically significant difference between them （t = 11.2532， P < 0.05）. The area percent of trabecular （TbAr%）， the number and the thickness of trabecular （TbN， TbTh） in the model group were all lower than those in the basic group， but the trabecular bone space （TbSp） was higher than that in the basic group， there were statistically significant differences （t = 3.5885， 7.4488， 9.0512， 10.0270， P < 0.05）. The TbAr%， TbN， TbTh in the treatment group were higher than those in the model group， while TbSp was lower than that in the model group， there were statistically significant differences （t = 2.3329， 5.3328， 5.9512， 10.9590， P < 0.05）. The maximum load， the maximum deflection and maximum stress in model group were lower than those in the basic group， there were statistically significant differences （t = 3.8944， 5.3915， 4.4739， P < 0.05 ）. The maximum load， the maximum deflection and maximum stress in the treatment group were higher than those in the model group， there were significant differences （t = 2.9251， 3.7628， 6.6926， P < 0.05）. Conclusion Chinese Medicine Fugu Prescription can increase BMD of GIOP rats with bone fracture， improve bone microstructure， improve bone biomechanical properties. Chinese Medicine Fugu Prescription can promote fracture healing of rats with GIOP.

[Key words] Chinese Medicine Fugu Prescription； Fracture； Healing； Bone histomorphometry； Biomechanics test； Glucocorticoid-induced osteoporosis

糖皮質激素（Glucocorticoid，GC）具有抗炎、抗病毒、抗免疫、抗休克等多種作用，由于GC良好和獨特的藥理作用，很多患者必須長期服用，大劑量長期使用糖皮質激素會對骨骼產生不良影響，造成糖皮質激素性骨質疏松，引發病理性骨折。目前，GC已成為繼發性雌激素缺乏、老年因素之后導致骨質疏松癥的第三大原因[1]。有調查表明，20%的患者在口服GC后的前12個月內發生了骨質疏松性骨折[2]，口服GC 5～10年后這一比例上升至50%[3]。骨折是糖皮質激素性骨質疏松癥（GIOP）最嚴重的副作用之一，GC引起的骨折常常延遲愈合，致殘率極高，又缺乏有效的預防和治療方法。GIOP所致骨折是臨床常見疾患，其發病急、愈合難，是骨科臨床領域的一項難題。本研究以肌內注射地塞米松致大鼠GIOP，并建立GIOP大鼠股骨閉合骨折模型，觀察分析中藥復骨方促進模型大鼠骨折愈合的作用機制，為臨床治療GIOP骨折探索新的藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取3個月齡雌性SD大鼠48只，清潔級，體質量（280±20） g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（粵）2008-0002。實驗過程中，所有動物在同等清潔環境下分籠飼養，飼養房溫度（24±1）℃，濕度50%～70%，每天光照與黑暗時間各12 h，喂飼全價營養鼠飼料（購自廣東中醫藥大學實驗動物中心，合格證號：No.11002900006734），自由進水。在動物處死前第3、4天及第13、14天頸部皮下注射鈣黃綠素20 mg/kg，進行體內熒光標記。

1.2 實驗藥物

地塞米松磷酸鈉注射液（天津藥業集團新鄭股份有限公司，國藥準字號H41021255，批號0807031）；青霉素（廣州白云山天心制藥股份有限公司，國藥準字號H20013260）；麻醉劑水合氯醛為國產分析純，3.5%水合氯醛（天津科密歐化學試劑有限公司生產，批號20110514）。

實驗用中藥復骨方由骨碎補、杜仲、續斷、千年健、紅花、歸尾、川芎等組成，藥材購自廣州大參林藥房，由廣州市番禺區何賢紀念醫院藥房加工，藥物煎煮后濃縮到含生藥0.5 g/mL藥液，4℃保存。

1.3 試劑與儀器

鈣黃綠素（美國Sigma公司，規格5 g，批號C0875）。實驗儀器：雙能X線儀DEXA（LUNAR-DPXIQ型，美國GE Lunar公司）；SP1600型切片機（德國Leica公司）；RM2500型包埋機（德國Leica公司）；J-D200生物顯微鏡（深圳拓天儀器設備有限公司）；TE2000型熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；計算機X射線攝像儀（日本柯尼卡美能達公司）；骨組織形態計量儀（型號OLYMPUS BX-51，美國BIOQUANT公司）；EleetroForce 3200生物材料實驗儀（美國Bose Corporation公司）；骨折造模支架參照文獻[4]制作。

1.4 方法

1.4.1 分組及建模 將實驗動物隨機分為3組，基礎組、模型組和治療組，各16只。每周稱體重1次，并按體重調整給藥劑量。基礎組：給予肌內注射生理鹽水1 mL/（kg·d），3次/周，8周后按照文獻[4]方法手術造成大鼠右側股骨骨折，骨折處采用金屬內固定，術后3 d常規抗感染處理，予肌內注射青霉素100萬U/kg。術后第2天開始給予蒸餾水10 mL/kg 灌胃，1次/d，持續8周。模型組：予肌內注射地塞米松（DEX）1 mg/kg，1次/d，3次/周，8周后手術造成大鼠右側股骨骨折，骨折處采用金屬內固定，術后常規抗感染處理同基礎組，術后第2天開始給予蒸餾水10 mL/kg灌胃，1次/d，持續8周。治療組：前8周造模同模型組，骨折術后第2天以中藥復骨方藥液10 mL/kg灌胃給藥，1次/d，持續8周。

1.4.2 骨密度測定 實驗8周末基礎組和模型組大鼠腹腔注射麻醉劑，以雙能X射線吸收儀及所附帶的小動物軟件測量大鼠活體全身骨密度（BMD），驗證骨質疏松模型的建立是否成功。16周末麻醉后處死大鼠，在無菌條件下取雙側股骨，4℃避光保存在70%乙醇中，應用DEXA以右側股骨骨痂為中心，掃描2 cm階段，測定骨痂骨密度值。骨密度采用單位面積內的骨礦物質含量表示（g/cm2）。

1.4.3 放射學觀察 骨折術后8周，在麻醉狀態下，大鼠俯臥位，雙下肢分開，膝關節微屈曲，用X線機拍右側股骨CR片，攝片條件為：投射球管距離標本90 cm，電壓45 kV，電流3.2 mA；觀察大鼠骨痂生長及骨折愈合情況。

1.4.4 骨組織形態計量學檢測 實驗16周末將大鼠按期處死后剝離股骨，分離股骨及所附著的組織，截取股骨干骺端組織，生理鹽水沖洗后，進行固定、乙醇梯度脫水，石蠟包埋，Leica機連續切片（5 μm），采用甲苯胺藍染色，在光學顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察其形態學改變，應用數字圖像分析系統測定骨組織形態參數。

1.4.5 生物力學測量[5] 16周末大鼠按期處死后剝離股骨，取術側股骨，剔除軟組織，拔除加鎖髓內針，濕生理鹽水紗布包裹-20℃冰箱保存備用。采用Electro Force 3200生物材料實驗儀分別行術側股骨三點彎曲實驗，支點跨距為20 mm，中央垂直（股骨與載荷成90°角）施加載荷，速率5 mm/min，測量和運算出各樣本的最大載荷、最大撓度和最大應力。

1.5 統計學方法

應用SSPS 12.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗大鼠骨密度的變化

骨折術前模型組與基礎組大鼠骨密度比較：實驗第8周末骨折術前，模型組大鼠BMD值為（0.219±0.013）g/cm2，基礎組BMD值為（0.283±0.015）g/cm2，模型組骨密度值顯著低于基礎組，差異有統計學意義（t = 12.8970，P < 0.05），說明GIOP模型建立成功。

實驗16周末各組大鼠股骨骨密度比較：治療組股骨BMD高于模型組，模型組BMD低于基礎組，差異均有統計學意義（均P < 0.05）。見表1。

表1 實驗16周末各組大鼠股骨骨密度比較（g/cm2，x±s）

注：t1為基礎組與模型組比較；t2為治療組與模型組比較

2.2 放射學檢查結果

實驗16周末，三組大鼠骨折部位愈合良好，骨折對位對線好，治療組、基礎組骨折部位的骨痂皮質厚于模型組，治療組與基礎組骨痂厚度無明顯差異。見圖1。

①基礎組；②模型組；③治療組

圖1 實驗16周末三組大鼠骨折部位CR片

2.3 骨組織形態計量學結果比較

骨折術后8周，模型組大鼠股骨骨小梁面積百分數（TbAr%）、骨小梁數量（TbN）、平均骨小梁厚度（TbTh）均較基礎組下降，骨小梁分離度（TbSp）較基礎組增高，差異有統計學意義（P < 0.05）；治療組TbAr%、TbN、TbTh均高于模型組，TbSp低于模型組，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

表2 各組大鼠股骨骨形態計量學測量結果比較（x±s）

注：t1為基礎組與模型組比較；t2為治療組與模型組比較

2.4 大鼠股骨生物力學測量比較

骨折術后 8 周對三組大鼠術側股骨進行生物力學比較，模型組和治療組的最大載荷、最大撓度及最大應力均低于基礎組，但治療組結果顯著高于模型組，模型組與基礎組、治療組與模型組間比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見表3。

3 討論

骨質疏松癥是公認的社會公共衛生健康問題，其發病率位居世界各種常見病的第6位[6]。繼發性骨質疏松癥是由于疾病或藥物等原因所致的骨量減少、骨微結構破壞、骨脆性增加和易于骨折的代謝性疾病[7]。引起繼發性骨質疏松癥的病因很多，由于GC在臨床上的廣泛使用，GIOP的發病率亦逐年提高，并成為最常見的繼發性代謝性骨病[8]。骨折是骨質疏松的主要并發癥，骨折的發生率在服用糖皮質激素的最初3～6個月即明顯增加[9]。骨質疏松性骨折以椎骨、腕部及髖部多見，其中以髖部骨折的發生率最高。英國的調查資料顯示，75歲以上女性每年有1%發生髖部骨折，髖部骨折占骨折病患的15%～25%[10]。骨質疏松癥患者骨強度低，抗骨折能力差，骨折發生率高，愈合慢，易發生內固定松動和再骨折，致殘率較高。

骨密度是反映骨量的主要指標，與骨折危險度密切相關。本實驗對大鼠肌注地塞米松8周后，模型組大鼠骨密度顯著降低，說明大鼠骨質疏松模型復制成功。實驗16周末，治療組股骨全長骨和骨痂BMD均高于模型組，說明復骨方治療可有效提高模型大鼠的BMD，促進骨折的愈合。

骨的力學強度和骨痂內骨結構是反映骨折愈合的重要指標，骨骼生物力學性能降低是骨折發生的主要原因之一[11]。骨組織形態計量學是應用數學和幾何學的方法，研究骨骼組織的結構和骨量等形態學靜態特性的測量技術[12]。三點彎曲試驗是生物力學中常用的方法。最大載荷反映了骨的剛度，最大應力反映骨質的內在硬度[13]。本實驗生物力學檢測以及骨形態計量學觀察結果顯示：骨折術后8周，治療組大鼠股骨TbAr%、TbN、TbTh均較模型組提高，TbSp較模型組下降，而模型組TbAr%、TbN、TbTh數據較基礎組降低，TbSp較基礎組升高；治療組最大載荷、最大撓度及最大應力結果顯著高于模型組。實驗結果提示，GC可使模型大鼠骨小梁數量、厚度減少，骨量減少，骨小梁分離度增加，骨強度降低，大鼠股骨生物力學性能下降，因而GIOP大鼠骨折風險增大。經中藥復骨方治療后，治療組大鼠的骨形態參數有所改善，骨量增加，骨小梁分離度降低，連接性加強，骨微結構得到加強改善，實驗大鼠的力學性能顯著提高，因此，中藥復骨方可促進模型大鼠骨折愈合。

我國傳統醫藥治療骨質疏松、骨折歷史悠久，清代陳士鐸在《百病辨證錄》中對骨折的治療提出了“血不活則瘀不去，瘀不去則新不能生，新不能生則骨不能合”。因此，中藥多應用補腎和活血化瘀類藥物治療骨折。中藥復骨方由骨碎補、杜仲、續斷、千年健、紅花、歸尾、川芎等組成，方中骨碎補能提高血鈣、血磷水平，激活成骨細胞，能明顯增加骨小梁寬度和密度， 減少骨小梁間隙[14]。杜仲能在骨折早期降低血鈣，升高血磷，促進骨痂生長和骨折愈合[15]。研究發現，續斷能有效促進大鼠成骨細胞分化、增殖，防止成骨細胞凋亡[16]，促進骨髓間充質干細胞增殖和向成骨細胞分化[17]，并且在一定的濃度范圍內可以促進人成骨細胞的分化和增殖[18]。千年健能夠增加成骨細胞和骨髓基質細胞（MSC）護骨素（OPG）蛋白及其mRNA表達，抑制細胞核因子-κB受體活化因子配基（RANKL）蛋白及其mRNA的表達，使骨形成大于骨吸收[19]。復骨方組方合理，以骨碎補、杜仲、續斷和千年健強腎壯骨，同時配伍歸尾、川芎和紅花行氣活血，化瘀止痛。

本實驗結果證實，中藥復骨方能夠提高GIOP骨折大鼠的BMD，增加骨小梁數量，使骨小梁增粗，骨小梁間隙變窄，改善骨的顯微結構，增強骨強度，提升骨生物力學性能。因此，中藥復骨方對模型大鼠骨折的愈合有促進作用。

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（收稿日期：2014-06-23 本文編輯：程 銘）

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（收稿日期：2014-06-23 本文編輯：程 銘）

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（收稿日期：2014-06-23 本文編輯：程 銘）