激光穴位照射佐劑性關節炎大鼠的生物效應累積及其鎮痛療效觀察

馬力佳,楊華元

(上海中醫藥大學,上海 201203)

炎癥痛是臨床上最常見的病理性疼痛之一,它的病程遷延反復,治愈難度大。已有實驗證明半導體激光針灸對緩解炎性疼痛有很好的療效[1]。本實驗采用傳統針刺治療與半導體激光穴位照射治療炎性疼痛,通過對AA大鼠血清中IL-1、IFN-γ、TNF-α含量的觀察,探討半導體激光鎮痛的療效以及其生物效應的特性,為下一步深層次探索激光的生物效應和指導臨床治療炎性疼痛提供實驗研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

清潔級健康成年SD大鼠80只,雄性,體重180～220 g,由上海中醫藥大學動物實驗中心提供。飼養環境溫度(24±2)℃,濕度控制在(45±5)%,適應性飼養1星期,普通飼料喂養,自由飲水。

1.1.2 主要儀器設備

YLS-12A型鼠尾光照測痛儀(北京吉安得爾科技有限公司),半導體激光發光管(上?？萍季┏?,YJ82/1型雙路直流穩壓電源(上海滬光儀器廠),華佗牌無菌針灸針(蘇州醫療用品廠)。

1.1.3 主要試劑

完全弗氏佐劑(Complete Freund’s adjuvant,CFA,購自美國 Sigma公司),水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司),ELISA試劑盒(白介素細胞-1、腫瘤壞死因子α、干擾素γ,購自南京建成生物工程有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 佐劑性關節炎大鼠模型制備

制備大鼠完全弗氏佐劑性外周急性炎癥痛模型,在嚴格無菌條件下,于每只大鼠右后足跖皮下注射弗氏完全佐劑0.1 mL。造模后4 h起大鼠右足足趾至踝關節逐漸出現紅腫疼痛,不能著地,跛行,各種行為學、形態學改變,痛閾值下降,示造模成功。

1.2.2 動物選穴

穴位選擇大鼠右側足三里穴。足三里(后三里)位于膝關節后外側,在腓骨小頭下約5 mm處。取穴方法參照《實驗針灸學》[2]及根據大鼠形態、解剖、生理特點而定。針刺7 mm。

1.2.3 實驗分組及干預方法

80只SD雄性大鼠隨機分為8組,每組10只?？瞻捉M、模型組大鼠置于大鼠固定器內固定,每天固定1次,固定時間每日20 min。

激光照射3 d組、5 d組、7 d組:將大鼠置于大鼠固定器內固定,取右側患肢足三里穴,激光照射20 min,每日 1次,分別治療 3 d、5 d、7 d。激光波長650 nm,輸出功率5 mW,光斑直徑3 mm。

針刺3 d組、5 d組、7 d組:將大鼠置于大鼠固定器內固定,用0.30 mm×25 mm毫針針刺右側患肢足三里穴20 min,行平補平瀉手法,每日1次,分別治療3 d、5 d、7 d。

1.2.4 取材

空白組、模型組與各治療組在各自療程結束并進行體重測量,腫脹度測量及痛閾測定后,用 10%水合氯醛以0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉,進行眼眶后靜脈叢取血1.5 mL,分離血清,放置于﹣80℃低溫冰箱保存待測。

1.3 指標檢測

1.3.1 體重及一般整體情況觀察

于造模前、治療后取材前觀察各組大鼠皮毛色澤、飲食、糞便、活動度等一般情況,測量大鼠體重,觀察其變化規律。

1.3.2 痛閾測定

于造模前、造模后、治療后采用光照甩尾法進行痛閾測定。為防止大鼠灼傷,設定鼠尾測痛儀功率為38 W,照射截止時間為 16.01 s,以防大鼠尾部灼傷。將待測大鼠用大鼠固定器固定,暴露整條尾巴,將尾尖對準測痛儀上的黑線,尾尖部遮蓋住光斑。待大鼠穩定后,按開始鍵計時,當鼠尾因熱輻射致疼痛而發生甩尾,尾尖離開光斑,計時自動停止,記錄時間,單位為s。每只大鼠分別進行3次測量,每隔5 min測量1次,最后取3次測量結果的平均值為該天測量的痛閾值。

1.3.3 踝關節周長測量

各組大鼠于造模前及造模第3天進行右后肢踝關節周長測定,用大鼠固定器將大鼠固定,兩后肢外露,自然下垂。用帶刻度的無彈性軟尺沿大鼠右后肢內外踝下緣平面繞踝一周,測得長度即為踝周長。為保證數據準確性,操作者每次掌握同樣的力度進行測量。

1.3.4 IL-1、TNF-α、IFN-γ、TLR4 含量的測定

大鼠血清樣本采用生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)測定,以450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值),測定應在加終止液后10 min以內進行。根據標準品的濃度及對應的 OD值計算出標準曲線的直線回歸方程,再算出對應的樣品濃度。

1.4 統計學方法

所有數據采用SPSS19.0軟件進行分析,數據呈正態性分布,所有結果以平均值±標準差表示。各組組間差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA),組間比較采用多重比較(LSD)分析,以P＜0.05作為有統計學意義的標準。

2 結果

2.1 一般情況及體重、踝關節腫脹度變化

模型組與空白組大鼠相比,在造模期間活動減少,精神萎靡,對外界刺激反應較遲鈍,飲食減少,糞便稀溏,毛色晦暗,毛發凌亂,右足跛行。模型組大鼠踝關節在造模12 h出現右足紅、腫、觸摸膚溫發熱,尤其在造模后24 h更為明顯。與模型組比較,治療后各組的一般狀況有所改善,活躍度較高,進食增加,毛發較順滑潔凈。

造模后模型組大鼠體重均值明顯小于空白組,具有統計學差異(P＜0.05),而各治療組大鼠體重均值與空白組比較差異有統計學意義(P＜0.05),且激光治療組大鼠體重高于針刺治療組,說明激光治療療效比針刺治療療效顯著。詳見表1。

造模后模型組與空白組對比,大鼠踝關節腫脹度具有差異性(P＜0.05),顯示造模成功;所有治療組與模型組比較差異均具有統計學意義(P＜0.05);且激光3 d、5 d、7 d組比較差異有統計學意義(P＜0.05),針刺3 d組與針刺7 d組比較差異具有統計學意義(P＜0.05);激光3 d組與針刺3 d組腫脹度比較差異有統計學意義(P＜0.05),提示激光治療組消炎效果比針刺治療組作用快。詳見表2。

2.2 痛閾測量結果

造模后,模型組痛閾與空白組相比顯著降低,且具有統計學意義(P＜0.05),顯示造模成功。治療后,激光組與針刺組痛閾比較差異具有統計學意義(P＜0.05)。激光3 d組與針刺3 d組的痛閾比治療前有所提高,且兩組痛閾與模型組比較差異具有統計學意義(P＜0.05),且均在治療第5天出現最低值,治療第7天有所上升,激光治療第5天與第7天痛閾相比差異具有統計學意義(P＜0.05),針刺治療第3天與第5天痛閾相比差異具有統計學意義(P＜0.05),說明激光與針刺治療均有鎮痛消炎作用,但激光治療顯效確比針刺治療及時。詳見表3。

表1 各組大鼠治療后體重比較(n=10)(±s,g)

表1 各組大鼠治療后體重比較(n=10)(±s,g)

注:與空白組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

組別 治療3 d 治療5 d 治療7 d空白組 193.60±10.102) 202.70±11.252) 212.20±11.022)模型組 170.40±9.061) 179.90±10.201) 189.60±10.221)激光組 166.00±16.961) 185.40±12.261) 184.50±10.181)針刺組 162.50±19.611) 178.50±5.641) 184.60±12.671)

表2 各組大鼠治療后踝關節腫脹度比較 (±s,cm)

表2 各組大鼠治療后踝關節腫脹度比較 (±s,cm)

注:與空白組比較 1)P＜0.05;與模型組比較 2)P＜0.05;與針刺組比較 3)P＜0.05;與同組治療 3 d比較 4)P＜0.05;與同組治療 5 d比較 5)P＜0.05

組別 治療3 d 治療5 d 治療7 d空白組 2.38±0.90 2.38±0.90 2.38±0.90模型組 3.70±0.211) 3.68±0.131) 3.54±0.151)激光組 3.45±0.611)2)3) 3.29±0.141)2)4) 3.07±0.131)2)4)5)針刺組 3.30±0.121)2) 3.21±0.121)2) 3.13±0.121)2)4)

表3 各組大鼠治療后痛閾比較 (±s,s)

表3 各組大鼠治療后痛閾比較 (±s,s)

注:與空白組比較 1)P＜0.05;與模型組比較 2)P＜0.05;與針刺組比較 3)P＜0.05;與同組治療5 d比較4)P＜0.05

組別 治療3 d 治療5 d 治療7 d空白組 8.03±1.54 8.03±1.54 8.03±1.54模型組 5.04±0.541) 4.61±0.831) 5.02±0.761)激光組 7.73±1.471)2)4) 4.86±0.901)3) 5.71±1.561)2)4)針刺組 7.66±1.801)2) 4.80±1.171) 5.60±1.121)4)

2.3 大鼠血清中炎性細胞因子 IL-1、IFN-γ、TNF-α的含量

激光3 d組大鼠血清IL-1含量與模型組比較差異具有統計學意義(P＜0.05)。激光組大鼠IL-1含量整體呈下降趨勢,治療第3天到第5天下降較明顯,治療第7天達到最低值。針刺組第3天到第5天IL-1呈下降趨勢,而治療第5天到第7天卻呈明顯上升趨勢。詳見圖1、圖2。

激光3 d組、針刺3 d組、針刺7 d組大鼠血清IFN-γ含量與空白組和模型組比較差異具有統計學意義(P＜0.05)。激光組 IFN-γ含量呈上升趨勢,且治療第3天到第5天上升較明顯,治療第5天到第7天趨于平緩;針刺治療第3天到第5天IFN-γ含量呈顯著上升,而針刺治療第5天到第7天IFN-γ含量呈下降趨勢,但仍高于針刺3 d組。詳見圖3、圖4。

圖1 激光組大鼠血清IL-1含量(ng/mL)

圖2 針刺組大鼠血清IL-1含量(ng/mL)

圖3 激光組大鼠血清IFN-γ含量(ng/mL)

圖4 針刺組大鼠血清IFN-γ含量(ng/mL)

與空白組相比,針刺5 d組和針刺7 d組大鼠血清TNF-α含量具有顯著性差異(P＜0.05);與模型組相比,激光3 d組TNF-α含量具有顯著性差異(P＜0.05);與激光3 d組相比,針刺3 d組TNF-α含量具有顯著性差異(P＜0.05)。激光組大鼠血清TNF-α含量整體呈下降趨勢,且治療第5天到第7天下降趨于平緩。針刺治療第3天到第5天大鼠血清TNF-α含量呈明顯下降趨勢,但第5天到第7天TNF-α含量卻呈輕微上升趨勢(詳見圖5、圖6)。以上均說明半導體激光穴位照射治療后,相關細胞因子均在治療第 5天出現轉折點,即體現了激光照射治療具有拋物線特征。而在治療7 d后,上述指標變化均呈緩慢增長或者下降趨勢,體現了隨激光照射時長的增加,激光生物效應的累積,顯示了其拋物線特性。

圖5 激光組大鼠血清TNF-α含量(ng/mL)

圖6 針刺組大鼠血清TNF-α含量(ng/mL)

3 討論

古代醫家對各種疼痛性疾病有一定的研究和認識,認為疼痛產生的重要原因是“通則不痛,痛則不通”,如《素問·舉痛論》:“寒氣入經而稽遲,泣而不行,客于脈外則血少,客于脈中則氣不通,故卒然而痛?！薄鹅`樞·五癃精液別》:“髓液皆減而下,下過度則虛,虛故腰背痛而脛酸?！奔す庋ㄎ徽丈浯鎮鹘y的針灸療法,把激光技術與傳統中醫理論相結合產生的激光針灸作為行之有效的治療手段,被稱為“21世紀的綠色療法”[3]。激光針灸具有無痛、無菌、簡便、安全、強度可調和適應范圍廣等特點,是一種符合現代醫學發展需要的全新治療方法[4-8]。本實驗通過對 AA大鼠的一般情況、體重、關節腫脹度、痛閾的觀察,證明了半導體激光照射和針刺足三里都能使AA大鼠關節紅、腫、熱等一般癥狀減輕,改善關節局部炎性組織病理性癥狀,但是半導體激光照射消炎鎮痛作用明顯優于針刺療法,說明半導體激光治療急性炎性疼痛的療效更加及時有效。

在炎癥發展過程中,病理性疼痛作為一種自覺癥狀存在其中,可以抑制免疫功能,從而加重炎癥本身免疫功能的紊亂[9]。外周組織損傷后,會釋放各種炎癥因子[10],導致受損神經末梢興奮或者敏感化,誘發疼痛和痛覺過敏并且維持其發展。其中免疫系統的重要介質細胞因子(cytokines,CKs)介導和調節固有免疫的因子能夠識別病毒和細菌,引起細胞因子的分泌;由細胞誘發產生的腫瘤壞死因子(tumor necrosis facor,TNF)、白介素-1(interleukin-1,IL-1)和趨化因子可以征募吞噬細胞到達局部引起全身性應答。本實驗研究的細胞因子包括 IL-l、TNF-α、IFN-γ,它們是形成關節炎重要的炎癥介質,這些細胞因子相互作用,促進炎細胞聚集活化,介質釋放,引起發熱,同時下調基質蛋白的合成、刺激基質蛋白酶和環氧合酶等,并各自發揮不同的抗炎作用[11-12],采用半導體激光治療后,這些炎性指標所反映的機體生物效應累積現象不盡相同,這可能與它們各自的特性有關。

IL-1是一種重要的促炎細胞因子,也是重要的免疫調節分子,主要由單核吞噬細胞產生,由機體炎癥、發熱急性期蛋白質合成,能誘導其他促炎細胞因子的釋放,啟動、加強、延長炎癥反應,具有致熱和介導炎癥的作用。Sweitzer等[13]發現SD大鼠腳底注射福爾馬林后注射部位的 IL-1β顯著增高,脊髓內給予 IL-1抑制劑阻斷了福爾馬林誘導的傷害行為,顯示在疼痛模型中IL-1β能夠誘發痛覺過敏。有實驗表明IL-l作用于內皮細胞,促進巨噬細胞、嗜中性粒細胞和淋巴細胞聚集,從而加重關節炎局部炎癥[14]。有學者[15]通過建立SD大鼠佐劑性關節炎(AA)模型實驗表明,IL-l明顯降低AA大鼠B淋巴細胞增殖和腹腔巨噬細胞IL-1的產生,可恢復T淋巴細胞增殖反應。提示IL-l可明顯減輕AA大鼠關節中炎性細胞浸潤、滑膜增生、血管翳難成、軟骨和骨的破壞。此外,有研究發現,IL-1抗體能有效地抑制小鼠膠原誘導性關節炎(collagen induced arthritis,CIA)關節軟骨和骨的破壞[16]。通過激光治療能減少血清中IL-1的含量,抑制其他促炎因子的釋放,控制炎性反應。

TNF是由單核巨噬細胞產生具有廣泛生物學活性的多肽調節因子,在機體的免疫防衛體系中起著十分關鍵的作用。它包括TNF-α和TNF-β,其中TNF-α與關節炎性疼痛的關系最為密切。TNF-α的作用機制類似于IL-1,因此,TNF-α和IL-1被稱為“姐妹細胞因子”,兩者的效應及靶細胞的范圍有很大相似性。比如TNF-α可以通過刺激滑膜細胞和軟骨細胞合成 PGE2和膠原酶,引起軟骨與骨的破壞,促進成纖維細胞增生;TNF-α與 IL-1常常又是同時合成分泌的,它們不但以自分泌方式刺激巨噬細胞的增加,而且也能促進彼此的合成。它們在聯合應用時能產生很強的協同作用,例如將重組 IL-1注射到大鼠或家兔的關節內能夠刺激關節軟骨的破壞,與 TNF-α聯合注射時,促使軟骨破壞的程度遠超過單獨注射IL-1所引起的效果[17]。通過本實驗也發現,激光和針刺足三里均能使大鼠血清中IL-1與TNF-α的含量明顯下降,AA大鼠的關節腫脹度明顯改善。說明TNF-α和IL-1能相互協調、促進,表現出協同性生物學效應。

IFN-γ又稱為免疫干擾素,主要由T和NK細胞產生,它能誘導巨噬細胞、T細胞、B細胞等細胞主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex Ⅰ、Ⅱ,MHC-Ⅰ、Ⅱ)類分子表達,從而提高抗原呈遞能力。IFN-γ能夠抑制滑膜細胞增殖,減少血管翳形成,抑制破骨細胞活性,減少對關節軟骨破壞,下調體液免疫反應。在動物實驗中[18],給RA模型小鼠使用抗 IFN-γ的抗體,可使RA緩解;而注射IFN-γ可使RA加劇。臨床有人給予人基因重組IFN-γ治療RA結果表明,IFN-γ對關節腫脹、晨僵改善明顯,淋巴細胞轉化率由治療前的異常升高降至正常范圍?？梢?IFN-γ在關節炎疼痛中發揮重要體內免疫調節作用,因此升高IFN-γ是治療炎性痛獲效環節之一[19]。在激光治療過程中,我們觀察到IFN-γ含量整體呈上升趨勢,說明半導體激光照射能夠促進 IFN-γ的分泌;同時 IFN-γ自身還能分泌 IL-1、TNF、IFN-α等細胞因子,所以在激光治療第5天到第7天IL-1、TNF-α的含量降低速度變緩,可能與IFN-γ含量增高呈正相關。

本實驗采用的是650 nm半導體激光,為近紅外譜段,對生物組織的穿透深度和升溫作用均大于 He-Ne激光,它被組織吸收后產生的熱能和化學能非常小,不會傷害到組織,卻起到了對機體產生刺激調整作用。加上其脈沖輸出、光管壽命長、體積小、價格低廉,所以是一種較理想的物理治療光源,素有人體黃金波段“生命之光”的美稱[20]。半導體激光照射AA大鼠足三里3 d后關節腫脹度明顯減輕,但7 d后腫脹度減輕程度沒有之前明顯;3 d治療后大鼠痛閾依舊是下降趨勢,在經過5 d治療后開始提高;IL-1與TNF-α的含量在治療3 d到治療5 d呈下降趨勢,治療5 d到7 d兩者的含量雖有下降,但沒有之前明顯。此外,激光3 d組血清中 IFN-γ含量顯著提高,但治療 5 d到 7 dIFN-γ增量速度明顯變緩。這些證實了激光多次小劑量照射和一次大劑量照射所引起的生物效應是一樣的,最終效應依賴于激光的總能量。即隨著激光照射次數的增加,其刺激量增強,反應強度會出現峰值,再增加刺激次數時,作用強度將明顯下降。因此,半導體激光照射消炎鎮痛作用在時間上明顯優于針刺療法,說明半導體激光治療急性炎性疼痛時能縮短療程。但是它的治療效果并不是越來越明顯,而是趨于平緩,即激光穴位照射存在著一定的累積效應。此外,半導體激光生物效應的累積及其拋物線特性在檢測不同的指標時,會呈現不一樣的結果,這個與檢測指標的特異性以及激光參數和生物特性,例如激光的波長、功率、振動模式和生物體穴位的吸光率、熱導率、靈敏度、弛豫時間等密切相關[21]。

本實驗選用的是AA大鼠急性關節炎模型,急性炎癥主要造成的是局部炎性的改變,而慢性炎癥還可能有局部炎部組織發生變性和壞死及全身性不良反應等繼發情況。隨治療時間延長,AA大鼠表現的急性炎癥反應進入了繼發狀態,引起全身免疫反應。激光治療主要起到消炎鎮痛的作用,且存在著生物效應的累積,因此半導體激光在治療急性炎癥時效果比較明顯,對于慢性炎癥的治療激光療效可能并不如針刺治療的療效,這些還有待下一步研究。

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