高效毛細管電泳法分析附子多糖中單糖組分

付 昆，葉 強

(1．四川省成都市第三人民醫院，四川 成都 610031;2．成都中醫藥大學，四川 成都 611137)

目前，多糖中單糖組成的分析主要采用紙層析、液相色譜、氣相色譜等方法，樣品用量大、試驗條件嚴格，毛細管電泳技術(CE)具有樣品用量少、時間短、靈敏度高、分離效果明顯的特點[1]，主要用于寡糖的分析。多糖的高效毛細管電泳(HPCE)研究目前尚處于探索階段[2]，由于單糖在水溶液中解離能力極差，在強堿條件下才能帶上電荷。使用含硼砂的緩沖液會讓單糖在較低的pH條件下帶上足夠的負電荷。不同的單糖在相同介質條件下與硼砂的絡合物具有有效淌度的差異，足以被毛細管電泳分辨。單糖的紫外吸收很弱，采用α-萘胺為衍生試劑使其帶上可被檢測的基團[3]。將多糖水解成單糖，再經過和標準單糖相同的處理。用毛細管電泳分析出其所含單糖的譜圖，與標準單糖的譜圖對照，即可得出多糖中單糖的種類與含量。本試驗中應用高效毛細管電泳對附子多糖中單糖組成及其含量進行測定，并確定HPCE試驗條件。

1 儀器與試藥

P/MDQ型高效毛細管電泳儀(美國Beckman公司);32Karasoft操作軟件;石英毛細管柱(50 μm × 75 cm，Beckman)。半乳糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖(國藥集團化學試劑公司);乙醇、丙酮、正丁醇、氯仿、α-萘胺、硼氰化氫鈉、硼砂等其他試劑均為分析純;所用水均為去離子水;附子藥材(四川省中藥飲片有限責任公司，批號為110701)。

2 方法與結果

2．1 多糖樣品制備

2．1．1 提取

干燥附子100 g粉碎后，用8倍量95%的乙醇回流提取2次，每次2 h，抽濾后所得殘渣干燥，加入8倍量水于90℃提取2次，每次15 h，水提液減壓濃縮至200 mL。冷卻后用95%的乙醇調節終濃度為80%，密封保存。次日用適量的無水乙醇、丙酮和石油醚依次抽洗，干燥后得淺褐色附子粗多糖。

2．1．2 純化

除蛋白:多糖25 g溶于50 mL水中，將10 mL的sevage液(氯仿∶正丁醇=4∶1)加入粗多糖液中，劇烈震蕩10 min后，以4 000 r/min的速率離心10 min。除去水相與有機相間的蛋白，將上層水相反復操作6次。

脫色:除蛋白后的多糖溶液調節pH為8～9，加入10%的H2O2250 mL置4℃冰箱中放置24 h。

透析:透析袋用50%的乙醇蒸制1 h，接著依次用0．01 mol/L的NaHCO3、0．001 mol/L的EDAE和蒸餾水洗滌。將脫色2 d后的多糖溶液裝入處理好的透析袋中，先用自來水流水透析2 d，然后用流動的蒸餾水透析2 d。

醇沉:將透析過的多糖液經70℃減壓濃縮至25 mL，待自然冷卻后加入95%的乙醇調節終濃度為80%，次日按上述方法處理得精制后的多糖。

2．2 電泳條件及緩沖液

運行緩沖液為 50，75，100 mmol/L 硼砂溶液。pH:9．5，10，10．5;柱溫:25℃;電壓:20 kV;檢測波長:214 nm;進樣氣壓:0．5psi;進樣時間:15 s。清洗液:0．1 mol/L HCL 溶液;0．1 mol/L NaOH 溶液;重蒸水。

2．3 單糖標準品的α-萘胺衍生化[4]

稱取 α-萘胺 143．2 mg和 NaBH3CN 35 mg，溶于450 mL無水甲醇中，再加入41 mL冰乙酸，置冰箱中待用。取各種單糖用重蒸水配成質量濃度為10 g/L的水溶液，各取200 mL，加40 mL衍生試劑置安瓿管中封管，80℃恒溫2 h衍生化。然后各加入三氯甲烷和重蒸水1 mL，反復離心萃取3次，取上層水相過濾后定容至5 mL，分別制成各單糖及混合單糖衍生溶液冷藏備測。

2．4 多糖水解樣品制備

取生附子多糖10 mg，加入2 mol/L H2SO41 mL，封管100℃恒溫水解8 h，冷卻后用碳酸鋇完全中和(pH=7)，放置過夜，過濾后取200 mL，按2．3項下方法進行衍生化。

2．5 標準品及樣品測定

取衍生化的標準品及樣品溶液按2．2項下所示條件測定遷移時間和峰面積，分別平行做3份，每份測3次。根據各吸收峰的峰面積計算各單糖組成的相對比例。

2．6 結果與分析

硼砂濃度及pH的選定:用硼砂做緩沖液，單糖混合物的分離度隨pH增加而增大，其最佳分離條件為pH=10．5，6種單糖的混合物完全分離。增加緩沖液中的硼砂濃度，能有效地增加分離度，但單糖的出峰時間亦有所延長。試驗用50 mmol/L時分離效果不好，在75 mmol/L時分離效果較好，100 mmol/L時電流較小，分離效果不好。結果最終確定硼砂緩沖液濃度為75 mmol/L，pH=10．5。

標準單糖譜圖:將6個單糖標準品電泳分析，得出各個單糖的出峰時間，與混合單糖標準品譜圖對照，得出每個標準單糖的電泳遷移時間。混合單糖標準品出現6個明顯的峰，得到了有效分離。混合單糖中鼠李糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖的遷移時間分別為 20．638，24．134，28．665，29．275，31．102，39．927 min。電泳譜圖見圖1(其中峰1為衍生試劑α-萘胺)。

圖1 混合單糖毛細管電泳圖

多糖樣品分析:將附子多糖作出的譜圖與標準混合單糖譜圖對照(見圖2)，根據其出峰時間的對應關系，可確定附子多糖由葡萄糖和半乳糖組成，其比例為 Glc ∶Gal=16．55 ∶28．72。單糖組成有鼠李糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、阿位伯糖、半乳糖，葡萄糖和半乳糖的遷移時間分別為28．285 min和39．254 min，相對峰面積分別為16．55%和28．72%。

圖2 附子多糖中單糖毛細管電泳圖

3 討論

本試驗中利用HPCE法檢測附子多糖單糖組成，取得了較好的分離效果，且操作簡單、精度高，可發展為檢測多糖中單糖組成的一種常用方法[5]。用α-萘胺將糖衍生化，使糖分子的還原端與其反應成為Schiff's堿，再利用NaBH3CN還原成仲胺[6]，引入了可供檢測的基團使糖形成硼酸鹽絡合物，帶上了固有電荷。試驗中發現，影響HPCE分離效果的主要因素是緩沖液的pH，增加的緩沖液pH可以使糖類的分離度相應地增加，但出峰時間相應延長;增加緩沖液濃度，電流變大，峰信號強度增強，選擇75 mmol/L的硼砂溶液分離效果良好。試驗結果表明，附子多糖主要由葡萄糖和半乳糖組成，其比例為Glc∶Gal=16．55∶28．72。

[3]賈國惠．糖類的高效毛細管電泳分析[J]．中國醫院藥學雜志，2003，23(8):492-493．

[4]耿 越，王暖波．花粉多糖組分的高效毛細管電泳分析[J]．山東科學，2001，14(4):10-13．

[5]Nicola V，Francesca M．Separation of capsular polysaccharide K4 and defructosylated K4 derived disaccharides by fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis(FACE)[J]．Carbohydrate Polymers，2005，61(3):327-333．

[6]張劍波，田庚元．糖類的高效毛細管電泳[J]．有機化學，1998，18(3):88-96．