基因工程菌發(fā)酵表達(dá)核苷磷酸化酶條件的優(yōu)化

黃炯威，莫世藝，劉 寧，梁劍鋒，劉桂禎

(1．開平牽牛生化制藥有限公司，廣東 江門 529339;2．廈門大學(xué)生命科學(xué)院，福建 廈門 361000)

核苷類似物的合成主要有化學(xué)合成法、堿基修飾法和生物轉(zhuǎn)化法3種方法[1]，前兩者工藝步驟多、反應(yīng)條件苛刻、周期長(zhǎng)、總收率偏低、成本居高不下，而酶法具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)專一性強(qiáng)、副反應(yīng)少、產(chǎn)物容易分離純化等優(yōu)點(diǎn)。核甘磷酸化酶已被廣泛用于酶法合成抗腫瘤、抗病毒的核苷類似物[2]。核苷磷酸化酶可分為嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase，EC2，4，2，1)和嘧啶核苷磷酸化酶(PyNPase，EC2，4，2，2)[3]。此酶能可逆地催化核苷(或脫氧核苷)磷酸化反應(yīng)[4]。利用核苷磷酸化酶已成功合成了阿糖腺苷(Ara2A)、2'－ 脫氧腺苷(2'－ Deoxyade nosine，dAR)、三氮唑核苷(Ribavirin)、5－氟尿苷(5－FUR)等。但利用含有核苷磷酸化酶的天然菌株合成核苷類藥物存在酶量小的缺點(diǎn)，構(gòu)建基因工程菌的方法可從根本上解決酶量問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)室獲得了2株含嘌呤核苷磷酸化酶與嘧啶核苷磷酸化酶基因的工程菌，對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行了詳盡地研究。通過(guò)優(yōu)化工程菌的產(chǎn)酶條件，現(xiàn)1 L發(fā)酵液可得2 g以上的酶蛋白，解決了酶的來(lái)源問(wèn)題，為酶法合成核苷類似物提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

BMR－A50U型50 L發(fā)酵罐(上海傲中生物工程設(shè)備有限公司);JY92－11N型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新藝超聲設(shè)備有限公司);VE－180型電泳槽(上海天能公司)，WD－9413B型凝膠成像分析儀(北京六一儀器廠)。菌種Gne01(PNPase工程菌)、菌種Gne02(PyNPase工程菌)為本實(shí)驗(yàn)室自有;異丙基硫代半乳糖苷(IPTG，Merck公司);培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基;其他檢測(cè)用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1．2 方法[5]

培養(yǎng)方法(搖瓶):在500 mL三角瓶中裝入60 mL含單磷酸卡那霉素的LB培養(yǎng)基，按2%的量接入種子液，在適宜溫度培養(yǎng)一定時(shí)間后加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，培養(yǎng)完成后收獲菌體。

菌體測(cè)定方法:取一定量的發(fā)酵液置離心管中，以4 000 r/min的速率離心10 min，倒出上清液，稱量離心沉淀的菌體質(zhì)量，計(jì)算出單位發(fā)酵液中菌體的質(zhì)量。

總蛋白測(cè)定方法:收獲的菌體用超聲波粉碎機(jī)破碎，以4 000 r/min的速率離心15 min，取上清液為待測(cè)樣品，以牛血清白蛋白(BSA)配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，按考馬斯亮藍(lán)(Bradford)法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測(cè)樣品的蛋白含量。

表達(dá)量測(cè)定方法:取蛋白測(cè)定樣品進(jìn)行SDS－PAGE電泳，再進(jìn)行凝膠成像掃描分析，結(jié)合總蛋白測(cè)定結(jié)果可計(jì)算出目標(biāo)蛋白表達(dá)量。

50 L發(fā)酵罐發(fā)酵方法:根據(jù)搖瓶培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)了L9(34)的正交試驗(yàn)方案，其中選擇了培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)開始時(shí)間、誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間為主要考察因素進(jìn)行條件優(yōu)化，研究50 L發(fā)酵罐的最佳發(fā)酵條件。

2 結(jié)果

2．1 酶表達(dá)影響因素考察

誘導(dǎo)時(shí)間:接種后，在搖瓶培養(yǎng)4 h時(shí)加入0．4 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，然后繼續(xù)培養(yǎng)10 h，每1 h取樣檢測(cè)菌體量和蛋白表達(dá)量，結(jié)果見圖1?？梢?，菌體在誘導(dǎo)后繼續(xù)快速生長(zhǎng)，到誘導(dǎo)后8 h菌體量和蛋白表達(dá)量達(dá)最高，時(shí)間再長(zhǎng)菌體量和蛋白表達(dá)量都會(huì)有小幅度下降，因此誘導(dǎo)后培養(yǎng)8 h菌體量和蛋白表達(dá)量均達(dá)到了高水平。

圖1 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)菌體量和蛋白表達(dá)量的影響

誘導(dǎo)時(shí)機(jī):接種后，在搖瓶培養(yǎng) 2，3，4，5，6 h時(shí)分別加入0．4 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)8 h，培養(yǎng)完成后檢查菌體量和蛋白表達(dá)量，結(jié)果見圖2。可見，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)菌量和表達(dá)量有較明顯的影響，誘導(dǎo)太早會(huì)明顯影響菌體生長(zhǎng)，從而影響蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)太晚雖然對(duì)菌體量影響不明顯，但明顯降低了蛋白表達(dá)量。因此，最佳的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)是在培養(yǎng)4 h時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)。

圖2 誘導(dǎo)前不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體量與蛋白表達(dá)量的影響

起始pH:配制不同起始pH的LB培養(yǎng)基，按2%的量接入種子液，在32℃培養(yǎng)4 h后加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，再培養(yǎng)8 h后收獲菌體檢測(cè)菌體量和蛋白表達(dá)量，結(jié)果見圖3?？梢?，試驗(yàn)范圍內(nèi)培養(yǎng)基起始pH的變化對(duì)菌體量和蛋白表達(dá)量的影響比較輕微，其中以起始pH在7．0～7．2為最佳條件。

圖3 不同培養(yǎng)基起始pH對(duì)菌體量和蛋白表達(dá)量的影響

培養(yǎng)溫度:接種后分別在 28，30，32，35，37 ℃培養(yǎng) 4 h，誘導(dǎo)后再培養(yǎng)8 h后收獲菌種，檢測(cè)菌體量和目標(biāo)蛋白表達(dá)量，結(jié)果見圖4?？梢姡囵B(yǎng)溫度對(duì)菌體量和蛋白表達(dá)量均有影響，在一定范圍內(nèi)，溫度越高菌體量越大，蛋白表達(dá)量越多，但溫度越高表達(dá)蛋白時(shí)越容易形成包涵體，因此培養(yǎng)溫度在30℃時(shí)為最佳條件。

圖4 不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌體量和蛋白表達(dá)量的影響

誘導(dǎo)劑濃度:搖瓶接種后在32℃培養(yǎng)4 h，分別加入0．25，0．3，0．35，0．4，0．45，0．5 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)，再培養(yǎng) 8 h 收獲菌體，檢測(cè)菌體量和蛋白表達(dá)量，結(jié)果見圖5?？梢姡T導(dǎo)劑濃度對(duì)菌體量和蛋白表達(dá)量影響比較明顯，誘導(dǎo)劑濃度的提高可令表達(dá)量明顯升高，當(dāng)誘導(dǎo)劑達(dá)到0．4 mmol/L及以上時(shí)，蛋白表達(dá)量不再明顯升高，但隨誘導(dǎo)劑濃度升高菌體量有一定程度的下降，因此誘導(dǎo)濃度為0．4 mmol/L時(shí)菌體量和蛋白表達(dá)量可達(dá)到較理想的水平。

圖5 不同誘導(dǎo)濃度對(duì)菌體量與蛋白表達(dá)量的影響

2．2 50 L發(fā)酵罐發(fā)酵條件優(yōu)化(正交試驗(yàn))

本試驗(yàn)采用 L9(34)正交試驗(yàn)方案，其中培養(yǎng)溫度選擇了30，32，35℃ 3個(gè)水平，誘導(dǎo)開始時(shí)間選擇了3，4，5 h 3個(gè)水平，誘導(dǎo)濃度為 0．3，0．4，0．5 mmol/L 3 個(gè)水平，誘導(dǎo)時(shí)間為 8，9，10 h 3個(gè)水平，通過(guò)正交試驗(yàn)以較少的試驗(yàn)次數(shù)來(lái)研究50 L發(fā)酵罐的最佳發(fā)酵條件。試驗(yàn)結(jié)果見表1和表2?？梢?，4個(gè)考察因素中誘導(dǎo)濃度對(duì)表達(dá)量影響最大，其次是培養(yǎng)溫度，影響最小的是誘導(dǎo)時(shí)間，為避免因溫度高導(dǎo)致表達(dá)蛋白形成包涵體，最終確定50 L發(fā)酵罐的最佳反應(yīng)條件是培養(yǎng)溫度32℃，接種4 h后加入0．4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間為9 h。

表1 Gne01菌種50 L罐發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表2 Gne02菌種50 L罐發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

3 討論

通過(guò)搖瓶培養(yǎng)試驗(yàn)考察了Gne01和Gne02 2個(gè)基因工程菌發(fā)酵條件，除了考察溫度、pH等條件外，也重點(diǎn)考慮了外源蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)劑的濃度和誘導(dǎo)時(shí)間等條件。由于外源蛋白的表達(dá)通常會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)，因此發(fā)酵條件優(yōu)化非常重要。本次考察的2個(gè)基因工程菌蛋白表達(dá)條件試驗(yàn)中，誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)的開始時(shí)間最重要，培養(yǎng)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間也對(duì)結(jié)果有較明顯的影響，而培養(yǎng)基起始pH的影響較弱。

為進(jìn)一步優(yōu)化工程菌發(fā)酵條件，為核苷磷酸化酶的工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用進(jìn)行更深入研究，根據(jù)搖瓶試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)方案進(jìn)行50 L發(fā)酵罐的發(fā)酵工藝優(yōu)化研究。結(jié)果顯示，各研究因素中對(duì)結(jié)果影響由大到小依次為誘導(dǎo)劑濃度、培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和誘導(dǎo)時(shí)間。50 L發(fā)酵罐的最佳條件為起始pH為7．0～7．2，于32℃培養(yǎng)4 h，加入終濃度為0．4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)9 h后收獲菌體，每升發(fā)酵液可得2 g以上的較高水平的酶蛋白表達(dá)量，達(dá)到了工業(yè)化生產(chǎn)要求。

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