運輸時間和密度對翹嘴鲌皮質醇、耗氧率及氧氣袋內水質的影響

胡培培 劉汝鵬 趙忠波 何 輝 樊啟學 宗克金

(華中農業大學水產學院, 武漢 430070)

活魚運輸主要有封閉式和開放式運輸兩大類型[1],能引起魚的應激反應, 對魚體造成損傷, 死亡率高等[2,3],而運輸時間、密度、水質等是影響活魚運輸成活率的主要因素, 尤其是水質惡化和累積效應[2,4]。氧氣袋充氧運輸具有運輸水的體積小, 成活率高等優點, 廣泛用于水產苗種運輸, 而運輸密度高會導致氧氣袋內水質迅速惡化,水體高游離CO2和氨氮濃度會導致苗種死亡[1,4,5], 還可產生過度擁擠效應[4], 脅迫后消耗大量能量[6]。因此, 合理的運輸制度包括合理的運輸密度, 其可保持良好的水質條件, 降低魚類應激水平, 提高存活率[2,4]。 翹嘴鲌(Culter alburnus Basilewsky)隸屬鲌亞科, 鲌屬, 中上層較大型經濟魚類, 具有較高營養價值, 但對捕撈、運輸等應激敏感。本實驗旨在研究運輸時間和密度對氧氣袋內水體氨氮、游離CO2、溶氧和pH的影響, 并對翹嘴 鲌全魚皮質醇水平以及脅迫后耗氧率的影響, 尋求苗種合理的運輸制度, 為實際生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗魚與裝置

實驗魚為人工繁殖的同一批魚, 全長(22.21±1.44) mm,實驗開始前暫養于水泥池(內裝水 15 m3)中, 放養密度為1.5 g/L, 微流水(換水量為10.5 L/min)養殖, 增氧機增氧,使DO>5.0 mg/L, 馴化2周, 每天定時飽食投喂魚苗微粒子飼料(山東升索漁用飼料研究中心; 粗蛋白≥41%, 粗脂肪≥8%)2次, 11:00—15:00遮陰。暫養期間, 每日監測水質情況: 水溫 25—31 ℃; pH 7.4—8.5; 亞硝態氮和H2S<0.05 mg/L; 氨氮<0.5 mg/L, 自然光照。正式實驗前停食 2d。實驗魚平均體重全長分別為: (0.21±0.04) g、(35.07±1.65) mm (n=1800); 肥滿度為(0.93±0.06) g/cm3。采用雙層塑料尼龍袋(45 cm×20 cm)充氧密封法運輸實驗魚, 路段設在華中農業大學和武漢繁生漁業科技有限公司(武漢江夏區流芳鎮)之間: 從漁場到流芳鎮為土路(6.5 km), 較顛簸, 從流芳鎮到華中農業大學為柏油路和水泥路(35 km)(武漢三環), 較平坦。運輸后實驗魚耗氧率測定采用密封式流水法, 參考陳寧生和施 瑔芳[7], 代謝瓶容積為1500 mL。

1.2 實驗設計

2013年7月8日(氣溫 28—35℃)7:10將實驗魚從水泥池中捕獲(水溫28.1℃), 實驗開始前先用冰塊將遮陰處池塘水調節為26℃, 用燒杯量取池塘水1.5 L, 之后倒入小盆中, 再將小盆放在電子天平(0.01 g)上并歸零, 然后用小網迅速撈魚并放入小盆中, 準確稱重后倒入氧氣袋中, 最后充入純氧2.5 L(氧氣流量表調節流量, 30 L/min),立即打包, 以尼龍袋膨脹無凹癟為度。運輸密度為 33、40、47和 54 g/L, 運輸時間為 0、2、4、6、8、10h, 采用4×6雙因素實驗, 各組設 3個平行, 并設 10個空白組(不裝魚), 并將帶有細線的溫度計放入空白組, 監測袋內水溫, 共 82包, 放入泡沫盒(水溫 26℃)中立即用面包車運輸, 運輸時間為 07:40—17:40。實驗期間, 監測水溫、車內氣溫(25℃)和車速, 土路為(20—25) km/h, 柏油路為(60—70) km/h, 學校水泥路為(30—40) km/h, 學校停留(3—5)min, 單程時間為1h, 往返重復10次。在運輸0、2、4、6、8、10h后, 每個代謝瓶放置各組魚8尾, 代謝時間為2h, 流速為100 mL/min, 實驗期間出水口溶氧在4 mg/L以上, 各代謝瓶又放置在盛水的大呼吸室中, 調節水溫為(27±0.5)℃, 遮光條件采用黑布覆蓋, 設 3個平行和 1個空白對照組; 實驗開始和結束時測定各代謝室進出水口溶氧, 實驗結束后測定代謝室魚的全長[游標卡尺(0.001 mm)]和體重[電子天平(0.001 g)]。

1.3 樣品采集與分析及參數計算

在運輸 0、2、4、6、8、10h時, 立即用便攜式溶氧儀(美國YSI556)測定各組氧氣袋內水體溫度、溶氧和pH;迅速用50 mL移液管取水樣, 測定游離CO2濃度(采用酸堿滴定法); 再用水樣瓶(500 mL)采集水樣, 測定氨氮濃度(采用預蒸餾—納氏試劑分光光度法); 取各組魚 8—10尾, 迅速放入液氮中, 測定全魚皮質醇水平(采用美國魚類皮質醇ELISA試劑盒法); 各項步驟的操作時間不超過30s, 并測定各組魚的全長和體重(n=30); 運輸 10h后,將各組取樣剩余的魚轉入玻璃水缸(340 L)中觀察 24h,記錄死亡數。

耗氧率(Oxygen consumption rate, RO)參考陳寧生和施 瑔芳[7]。

1.4 統計分析

數據以平均值±標準差(x ±SD)表示, 采用SPSS 18.0軟件進行雙因素方差分析(two-way ANOVA analysis)(翹嘴 鲌體重、水溫作為協變量), Duncan 氏法比較差異顯著性; 顯著水平P<0.05。

2 結果

2.1 運輸時間和密度對翹嘴鲌氧氣袋內水質變化的影響

在整個運輸中氧氣袋內水溫為(26.0—27.5)℃, 氧氣袋內水質變化情況如表 1。水體溶氧(Dissolved oxygen;DO)和 pH隨運輸時間和密度的增加而顯著降低, 氨氮(Total ammonia nitrogen; TAN)和游離CO2濃度則隨它們的增加而顯著升高, 且交互作用顯著; 在運輸 0—2h時,各組DO和pH呈現大幅度的下降趨勢, 單位時間平均下降了7.33 mg/L和0.34, TAN呈現大幅度的上升趨勢, 單位時間平均上升了2.93 mg/L, 而游離CO2表現在(2—4)h,單位時間平均上升了 8.87 mg/L, 之后變化緩慢; 運輸(8—10)h時, 各組DO、pH、TAN和游離CO2濃度再次呈現較大幅度的變化趨勢; D3、D4組DO分別于運輸8、10h降到10 mg/L以下。在整個運輸中, 水體DO、pH、TAN和游離CO2單位時間變化值隨密度的增加而增大。

表1 運輸時間和密度對氧氣袋內水體中溶氧、pH、氨氮和游離二氧化碳的影響Tab.1 Effect of transportation time and density on water dissolved oxygen, pH, ammonia nitrogen and carbon dioxide free in polyethylene bags

2.2 運輸時間和密度對翹嘴鲌全魚皮質醇和耗氧率的影響

在本實驗條件下, 各組魚存活率為 100%, 翹嘴鲌全魚皮質醇水平及脅迫后耗氧率(RO)隨密度的增加而顯著增大, 隨運輸時間呈現先升高后降低再升高的趨勢,且都顯著高于對照水平(運輸 0h), 交互作用不顯著(圖1)。各組皮質醇水平都于運輸2h達到峰值, 之后開始下降, 而D2—D4組皮質醇水平又于運輸8h后開始上升。各組RO都于運輸4h達到峰值。運輸時間的主效應更為突出。

圖1 運 輸時間和密度對翹嘴 鲌全魚皮質醇、耗氧率的影響Fig. 1 Effect of transportation time and density on whole-body cortisol and oxygen consumption rate of Culter alburnus

3 討論

3.1 運輸時間和密度對全魚皮質醇水平的影響

運輸包括捕獲、轉載、禁錮等一系列連續的強刺激性操作協迫是常見的復合應激因子, 皮質醇等激素水平的升高, 進而誘發魚體代謝速率加快、抗病性和耐低氧能力等減弱, 其成活率也顯著下降[2,4,8]。在運輸2h內, 翹嘴鲌全魚皮質醇水平顯著上升了 1.9—2.2倍, 之后開始下降。在運輸脅迫后, 革胡子鲇(Clarias gariepinus Valenciennes)血清皮質醇水平顯著上升了4—5倍, 水體氨氮濃度也顯著高于對照水平[9]; 重復而長時間的禁錮脅迫下,虹鱒(Salmo gairdneri Walbaum)血清皮質醇水平一直上升,并于16.5h時達到220 ng/mL, 是對照水平的110倍[10]; 在急性應激后, 銀鯰(Rhamdia quelen Quoy et Gaimard)和羅非魚(Oreochrmis niloticus Linnaeus)全魚皮質醇水平都顯著升高, 但羅非魚應激水平更為強烈和持久, 其解釋為羅非魚為日間活動魚類[11]; 而 Barton等[12]發現, 在空氣暴露或運輸脅迫后, 鱘形目魚類血清皮質醇水平差異不顯著。翹嘴 鲌全魚皮質醇水平隨密度的增加而增加, 運輸8h后, 水質惡化和擁擠效應表現突出。彭士明等[13]運輸銀鯧(Pampus argenteus Euphrasen)12h, 血清皮質醇水平隨運輸密度的增加而增加, 并于運輸 4h達到峰值(7—9) ng/mL, 16 g/L密度組加重了幼魚應激反應, 死亡率也升高; 而對缺簾魚(Brycon cephalus Günther)的研究發現,血清皮質醇水平隨運輸密度的增加而降低, 其解釋為高密度組幼魚“侵略行為”減弱[3]。因此, 魚體應激水平與密度、魚的種類、脅迫方式等密切相關。

3.2 運輸時間和密度對氧氣袋內水質變化的影響

水質是影響活魚運輸魚的健康、應激水平和存活率的主要因素之一, 其中包括游離CO2、氨氮、DO和PH[2,4]。對黃尾(Seriola lalandi Valenciennes)[14]、大西洋鮭(Salmo salar Linnaeus)[15]和尖吻鱸(Lates calcarifer Block)[16]的研究表明, 運輸脅迫后魚體皮質醇水平顯著升高, 鰓血流速度、代謝速率等加快, 耗氧增加, 氨氮和CO2等代謝產物也隨之增加并迅速溶于水體, 降低水體pH。Colburn等[17]運輸軍曹魚(Rachycentron canadum Linnaeus), 氧氣袋內水體DO和pH隨運輸密度的增加而顯著降低; Golombieski等[18]運輸銀鯰苗種(水溫 25℃),各組氧氣袋內水體氨氮和游離 CO2濃度隨運輸時間和密度的增加顯著上升, 而DO隨運輸時間的增加呈現波動變化; 類似的, Urbinati等[3]運輸缺簾魚, 166 g/L密度組氧氣袋內水體氨氮濃度低于125 g/L密度組, 其解釋為低密度組幼魚“侵略行為”增強, 活動增加。相對大規格魚類, 實驗魚對運輸脅迫極為敏感, 時間和密度交互作用顯著。

Moran等[14]運輸黃尾幼魚, 30min內, 水體游離CO2升到20 mg/L, pH從8.2降到7.2; 氧氣袋內水質的迅速變化通常發生在運輸(1—2)h內, 且應激持續時間與運輸時間和密度成正相關[2,4,15]。在本實驗條件下, 翹嘴鲌峰值應激壓力發生在運輸(0—2)h; 運輸(8—10)h時, 水體氨氮和游離CO2濃度高, 成為新的應激源, 且協同作用表現突出, 稚魚代謝再次增強。尖吻鱸暴露在(12.6—21.6) mg/L氨氮濃度下, 血紅蛋白運輸氧能力降低, 鰓呼吸速率加快[16]; 黃尾暴露在75 mg/L CO2濃度下, 幼魚出現嚴重的血碳酸過多癥[14]; 而對真鯛(Pagrus pagrus Linnaeus)的研究發現, 水體氨氮濃度大于 7.94 mg/L時,仔魚便出現死亡, 且死亡率與氨氮濃度成正相關[19]; 運輸成年大西洋鮭, 水體 CO2對其亞致死濃度為19.60 mg/L[15]。在運輸結束時, D4組密度最大, 水質條件最差, 實驗魚出現側翻現象。運輸時間為(10—15)h時,鯉科魚類夏花苗種適宜運輸密度為(250—375)尾/L(水溫25℃)[1]; 運輸時間為6h、9h、12h時, 大蓋巨脂鯉(Colossoma macropomum Cuvier)的密度上限依次為90、80、70尾/L,氧氣袋內水體 CO2濃度低于 100 mg/L, 稚魚存活率為95%—100%[5]; 運輸軍曹魚時, 應保持水體pH、DO分別在7.0、(6.0—8.0) mg/L以上, 其密度不易超過20 kg/m3[17]。因此, 水質條件可決定運輸密度, 在活魚運輸中, 良好的水質條件包括DO飽和度在90%—100%以上, CO2濃度在(30—50) mg/L 以下[2,4]。

3.3 運輸時間和密度對翹嘴鲌耗氧率的影響

運輸使魚類產生持續運動, 其中包括能量代謝等生物學功能的改變, 以清除水質變化等產生的不利影響,維持內穩態[3,4]鲌。運輸脅迫后翹嘴 稚魚耗氧率依次為對照水平的 1.39、1.60、1.33、1.30、1.49倍, 并隨密度的增加而增大。在 2.5h低氧暴露后, 鯉魚(Cyprinus carpio Linnaeus)和黑鯽(Carassius carassius Linnaeus)[20]的耗氧率顯著上升, 代謝率增加到最大耗氧率的 60%, 恢復時間為7.0h和3.8h; 力竭運動后南方鲇(Silurus meridionalis Chen)耗氧率迅速升高了4—5倍, 之后開始下降, 而間隔10min的重復運動使幼魚耗氧率一直保持在0.36 mg/(g·h)以上, 其為靜止水平的 2—4倍[6]。運輸(0—4)h, 急性應激反應使稚魚消耗大量能量用于組織恢復與更新, 魚體最大代謝率出現在這一階段。急性升溫, 大西洋鮭幼魚耗氧率大且快的上升, 而慢性升溫, 其耗氧率上升緩慢, 且與升溫前差異不顯著[21]; 曾令清等[22]研究也表明, 急性變溫顯著影響南方鲇耗氧率。因此, 耗氧率與魚的種類和應激水平密切相關, 運輸 8h后, 慢性脅迫表現突出, 更會使魚類能量耗竭, 恢復時間更長。

運輸結束的2周內,南亞野鯪(Labeo rohita Hamilton)苗種死亡率從2.13%上升到45.83%, 可稱其為“運輸損失”[23],運輸脅迫長期影響魚的生長與健康[2,4]。在本實驗條件下, 運輸時間為 10h時,翹嘴鲌苗種合理的運輸密度為(47—54) g/L。