擬目烏賊卵子發生與卵巢發育

羅 江 蔣霞敏 柳敏海 唐 鋒 彭瑞冰

(1. 寧波大學海洋學院, 寧波 315211; 2. 浙江省舟山市水產研究所, 舟山 316000)

卵子發生是個體發育的重要環節之一, 卵子的質量好壞直接影響到受精過程以及受精卵的發育,而卵巢發育程度的好壞直接決定卵子的質量[1]。關于頭足類卵子發生和卵巢發育的研究, 國外較多,主要集中在皮氏槍烏賊(Loligo pealei)[2]、巴塔哥尼亞槍烏賊(Loligo gahi)[3]、福氏槍烏賊(Loligo forbesi)[4]、狼烏賊(Lycoteuthis lorigera)[5]、尖盤艾爾斗蛸(Eledone cirrhosa)[6]和真蛸(Loligo vulgaris)[7]等,國內鮮有報道, 僅見曼氏無針烏賊(Sepiella maindroni)[8]、金烏賊(Sepia esculenta)[9]和長蛸(Octopus variabilis)[10], 迄今為止, 未見擬目烏賊(Sepia lycidas)相關報道。

擬目烏賊隸屬于軟體動物門(Mollusca)、頭足綱(Cephalopoda)、鞘亞綱(Coleoidea)、烏賊目(Sepiida)、烏賊科(Sepiidae)、烏賊屬(Sepia), 為淺海暖水性較強的底棲種, 20世紀80年代前我國東海有分布, 目前主要分布在南海[11]。因其個體大, 生長快, 具有較高的營養價值和人工養殖前景, 已引起國內外學者的關注[12—23]。2013年5月, 本課題組率先突破了擬目烏賊規模化人工育苗技術, 為其人工養殖的研究奠定了基礎。本文采用解剖學和組織學的方法,對水泥池養殖條件下擬目烏賊卵子發生和卵巢發育進行了研究, 闡明了擬目烏賊卵子發生和卵巢發育規律, 可豐富頭足類發育生物學理論知識, 對擬目烏賊人工育苗和養殖具有十分重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2013年2—11月進行, 擬目烏賊親體捕自廣東省湛江市硇洲島海域(21.11°N, 110.24°E), 經自然交配產卵, 在浙江省舟山市水產研究所朱家尖基地進行孵化, 孵化水溫為(19—21)℃, 鹽度為24—26, 烏賊幼體孵出后在4.0 m×5.0 m×1.2 m的水泥池內進行培育, 培育水溫為(20—32)℃, 鹽度22—30, 連續充氣, 充氣頭1個/m2。日投餌2次, 投餌種類和投喂量隨烏賊個體的增長而改變: 0—45日齡(胴長 0.72—3.83 cm)投喂活糠蝦(0.5—1.0 cm), 投喂量(10—20) ind./L; 45—90日齡(胴長3.83—6.52 cm)投喂冰鮮小雜魚, 切成長條狀(1.5 cm×1.0 cm), 日投喂量為體重的18%; 90日齡以后(胴長6.52 cm以上)投喂冰鮮小雜魚, 切成長條狀(3.0 cm×1.0 cm),日投喂量為體重的12%。每天換水1—2次, 換水量80%—100%。

1.2 方法

取樣 從剛孵化出膜的小烏賊開始, 1d取樣一次, 10d后每隔3天取樣一次, 45d后每隔15d取樣一次, 每次隨機取樣10只, 對于肉眼不能分辨性腺的個體, 用波恩氏液整體固定4h后, 切取胴部后段,換新的波恩氏液保存于 4℃冰箱中; 對于肉眼可分辨性腺的個體, 直接取性腺固定, 24h后換新的波恩氏液保存于4℃冰箱中。

組織學切片 酒精梯度脫水, 二甲苯透明,石蠟包埋, KD-2508型輪轉式切片機連續切片, 切片厚度(5—8) μm, HE染色, 中性樹膠封片, OlympusBX-50型熒光顯微鏡觀察并拍照。

數據測量與處理 記錄烏賊日齡(Age)、體重(W)、胴長(ML)和卵巢重(Wo), 細胞直徑和細胞核直徑直接在顯微照片上測量, 按以下公式分別計算核質比(NP)和性腺指數(GSI):

其中, Vn為細胞核的體積, Vc為細胞體積, 由公式V=4/3πR3求得。

2 結果

2.1 卵子發生分期

擬目烏賊卵子發生不同步, 根據細胞形態、細胞大小、濾泡細胞形態和卵黃形成情況可以分為卵原細胞階段(卵原細胞期)、原生質生長階段(無濾泡期、單層濾泡期和雙層濾泡期)、間質生長階段(濾泡內折早期、濾泡內折中期和濾泡內折晚期)和營養質生長階段(卵黃發生早期、卵黃發生晚期和成熟期), 共4個階段, 10個時期。

卵原細胞階段 第1期 前期卵原細胞期。前期卵原細胞形狀不規則或略呈圓形, 直徑為(12—15) μm, 細胞核呈圓形, 直徑為(10—12) μm, 細胞核占據整個細胞的絕大部分(圖版Ⅰ-1), NP為1.049—1.373。

原生質生長階段 一部分卵原細胞經過有絲分裂繼續保持增殖能力, 另一部分卵原細胞經過減數分裂發育為卵母細胞。此時, 細胞直徑和細胞核直徑均不斷增加, 細胞質繼續增多, 根據濾泡細胞的形態和分布的變化將此階段分為無濾泡期、單層濾泡期和雙層濾泡期3個時期。

第 2期 無濾泡期。細胞呈圓形或橢圓形, 直徑為(40—170) μm, 細胞核呈橢圓形, 直徑為(25—90) μm (圖版Ⅰ-2), 細胞外圍沒有濾泡細胞,NP為0.174—0.492。

第3期 單層濾泡期。細胞呈圓形或橢圓形, 直徑為(220—310) μm, 細胞核呈橢圓形, 直徑為(100—120) μm (圖版Ⅰ-3), NP 為 0.062—0.103。隨著卵母細胞體積的增大, 扁平的濾泡細胞(長9—12 μm)開始從卵母細胞的一側, 逐漸附于細胞膜上, 包圍整個卵母細胞, 形成單層濾泡細胞層(圖版Ⅱ-1)。

第4期 雙層濾泡期。細胞呈圓形或橢圓形, 直徑為(290—380) μm, 細胞核呈橢圓形, 直徑為(110—130) μm (圖版Ⅰ-4), NP 為 0.042—0.073。卵母細胞體積繼續增大, 濾泡細胞繼續附于細胞膜上,形成雙層濾泡細胞層, 內層濾泡細胞變為橢圓形,直徑為(7—10) μm, 外層濾泡細胞呈扁平狀, 長為(10—15) μm (圖版Ⅱ-2)。

間質生長階段(濾泡內折階段) 間質生長階段也可以稱為濾泡內折階段, 主要特征是濾泡細胞開始向卵母細胞內部折疊, 并逐漸占據整個卵母細胞。根據濾泡細胞的分布情況, 可以將此階段分為早期、中期和晚期3個時期。

第5期 濾泡內折早期。細胞呈圓形或橢圓形,直徑為(340—400) μm, 細胞核呈圓形或橢圓形, 直徑為(150—170) μm (圖版Ⅰ-5), NP 為 0.083—0.094。位于內層的橢圓形濾泡細胞先向卵母細胞內部延伸,形成 8—10個指狀突起, 這些指狀突起的長度大體一致, 長為(30—40) μm (圖版Ⅰ-5、圖版Ⅱ-3)。

第6期 濾泡內折中期。細胞呈圓形或橢圓形,直徑為(390—470) μm, 細胞核呈圓形或橢圓形, 直徑為(160—180) μm (圖版Ⅰ-6), NP 為 0.060—0.074。濾泡細胞繼續向卵母細胞內部延伸, 占據了整個細胞的一半左右, 指狀突起的數量增加到 10—12個,長(80—170) μm 不等, 且有些指狀突起出現分支(圖版Ⅰ-6), 位于外層扁平的濾泡細胞直徑縮短至(8—10) μm, 隨著指狀突起的深入, 也延伸至卵母細胞內部(圖版Ⅱ-4)。

第 7期 濾泡內折晚期。細胞呈橢圓形, 體積急劇增大, 直徑為(1000—1200) μm, 細胞核呈橢圓形, 直徑為(150—180) μm, 偏向細胞一側(圖版Ⅰ-7), NP為 0.003—0.005。指狀突起不斷延伸和分支, 相互連接呈網狀, 占據整個卵母細胞, 扁平的濾泡細胞消失(圖版Ⅱ-5)。

營養質生長階段 濾泡細胞占據整個卵母細胞后逐漸解體, 細胞核也消失不見, 與此同時, 卵黃物質開始積累, 根據濾泡細胞的分布和卵黃的積累情況, 將此階段分為卵黃發生早期、卵黃發生晚期和成熟期3個時期。

第 8期 卵黃發生早期。細胞呈橢圓形, 直徑為(1500—1800) μm, 網狀的濾泡細胞從卵母細胞的中間開始解體(圖版Ⅰ-8), 解體的濾泡細胞邊界不明顯, 直徑為(7—10) μm, 相互堆積(圖版Ⅱ-6), 細小的顆粒狀卵黃物質相互聚集, 呈小塊狀, 被HE染成淡藍色(圖版Ⅰ-8)。

第9期 卵黃發生晚期。細胞體積急劇增大, 呈橢圓形, 直徑為(2300—2900) μm, 大部分濾泡細胞已經解體, 整個卵母細胞充滿了卵黃物質, 呈塊狀,被染HE成橘紅色(圖版I-9)。

第10期 成熟期。成熟卵子呈黃色透明的橢圓形, 直徑為(6000—7000) μm, 內充滿了大量卵黃,切片時容易破碎, 因而未獲得組織學結構。

2.2 卵巢發育分期

根據卵巢外觀形態、性腺指數變化和切面上各期細胞所占的比例, 將擬目烏賊卵巢發育分為形成前期、形成期、小生長期、大生長期、成熟前期和成熟期6個時期。

Ⅰ期 形成前期 烏賊日齡 23—31d, 體重(3.03—4.82) g, 胴長(2.43—3.22) cm, 性腺肉眼不可見, 組織切片觀察到卵巢位于胴體基部, 切面上生殖細胞均為卵子發生第1期的細胞, 少量被HE染成深藍色的扁平濾泡細胞散布于卵巢中(圖版Ⅲ-1、表 1)。

Ⅱ期 形成期 烏賊日齡 31—45d, 體重(4.82—8.56) g, 胴長(3.22—3.83) cm, 性腺位于體腔后部, 包被于體腔膜中, 肉眼不容易觀察到, 呈乳白色, 細條狀, 長約 4 mm, 重(0.01—0.02) g, 性腺指數為 0.16—0.28, 組織切片觀察, 卵巢內生殖細胞以卵子發生第 2期細胞為主, 占整個切面的83.66%, 還分布著少量第 3期(13.96%)和第 1期(2.38%)的細胞(圖版Ⅲ-2、表 1)。

Ⅲ期 小生長期 烏賊日齡 45—150d, 體重(8.56—133.81) g, 胴長(3.83—11.20) cm, 肉眼明顯可見卵巢呈乳白色, 扁平狀, 緊貼體腔膜, 大小(6—8) mm, 重(0.02—0.23) g, 性腺指數為 0.12—0.26, 組織切片觀察, 卵巢內生殖細胞以卵子發生第4期細胞為主, 占整個切面的50.01%, 其次為第3期細胞(36.33%), 仍然可見少量第2期(11.34%)和第1期(1.09%)細胞, 且切面上出現了部分退化吸收的卵母細胞, 占整個切面的1.23% (圖版Ⅲ-3、表1)。

Ⅳ期 大生長期 烏賊日齡 150—180d, 體重(133.81—256.34) g, 胴長(11.20—13.55) cm, 卵巢呈乳白色, 扁平狀, 肉眼可觀察到卵巢表面具有凹凸不平的卵粒, 此期卵巢開始快速增長, 大小(12—18) mm, 重 (0.23—1.56) g, 性 腺指 數 為0.17—0.72, 組織切片觀察, 卵巢內生殖細胞以卵子發生第6期細胞為主, 占整個切面的50.27%, 其次為第5期細胞(18.83%), 第1期細胞不再出現(圖版Ⅲ-4、表1)。

Ⅴ期 成熟前期 烏賊日齡 180d后, 體重達256.34 g以上, 胴長達13.55 cm以上, 卵巢繼續增長, 乳白色, 葡萄狀, 大小(20—25) mm, 重 1.56 g以上, 性腺指數 0.65以上, 肉眼可見橢球形的卵母細胞呈串排列。組織切片觀察, 卵巢內生殖細胞以卵子發生第 8期細胞為主, 占整個切面的 61.85%,退化吸收的卵母細胞增多, 占整個切面的2.05% (圖版Ⅲ-5、表1)。

Ⅵ期 成熟期 成熟卵巢從親體中獲得, 此時烏賊已經性成熟, 體重(950.33—2010.28) g, 胴長(20.80—27.75) cm, 卵巢呈淡黃色, 葡萄狀, 充滿整個胴體后部, 重(31.35—75.23) g, 性腺指數為2.82—4.05, 淡黃色的成熟卵子游離到生殖腔中, 偶見的未成熟卵子呈乳白色(圖版Ⅲ-6、表1)。

3 討論

3.1 關于性成熟和繁殖周期

頭足類繁殖周期不同種類之間存在較大差異,韋柳枝等認為金烏賊為一年性成熟, 繁殖周期為一年[24]; Goff和 Daguzan研究發現烏賊(Sepia officinalis)有兩種繁殖群體, 第一種群體的數量和個體均較小, 繁殖周期為一年, 第二種群體的數量和個體均較大, 繁殖周期為 2年[25]; 曼氏無針烏賊在自然條件下一年只繁殖一次, 而在人工養殖條件下, 春季產出的幼體在秋季即可達到性成熟, 一年有兩次繁殖期[26]。本實驗表明, 擬目烏賊孵化出膜后, 經過 4—6個月的水泥池養殖, 平均體重為 256.34 g,最大體重可達到 457.08 g, 大部分個體的卵巢發育至第Ⅳ期, 個別已發育至第Ⅵ期, 達到性成熟, 因此我們推測人工養殖條件下擬目烏賊一年可達到性成熟, 繁殖周期為一年。一般來說頭足類達到性成熟后, 即交配、產卵, 隨后大量死亡, 特別是曼氏無針烏賊性早熟現象普遍, 養殖3—4個月, 長至50 g左右就性早熟, 交配產卵, 伴隨大量死亡, 這嚴重挫傷了養殖戶的積極性, 阻礙了烏賊養殖業的發展,而擬目烏賊生長快, 養殖 4—6個月就可長至250—500 g, 達到商品規格, 而且只出現個別性成熟, 這為養殖戶帶來了福音。

表1 擬目烏賊卵巢發育不同時期切面上各期細胞所占的比例Tab. 1 Percentage of each oocyte at the sections during ovaries development in Sepia lycidas

3.2 關于卵子發生和卵巢發育的分期

關于頭足類卵子發生的分期, 不同學者的分類依據不盡相同。Bottke[27]根據濾泡細胞形態變化, 將錐異尾槍烏賊(Alloteuthis subulata)的卵子發生分為了Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 3個階段, 而Selman和Arnold[2]根據濾泡細胞形態變化將皮氏槍烏賊卵子發生分為了Ⅰ—Ⅴ 5個階段, Boyle和Chevis[6]根據卵黃發生情況將尖盤艾爾斗蛸卵子發生也分為了Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3個階段, 蔣霞敏等[8]和李來國[10]根據細胞大小、細胞核形態和濾泡細胞形態變化分別將曼氏無針烏賊和長蛸卵子發生分為卵原細胞期、卵母細胞期、成熟期和退化期4個階段。本文綜合根據細胞形態、細胞大小、濾泡細胞形態和卵黃發生情況, 將擬目烏賊卵子發生分為卵原細胞、原生質生長、間質生長和營養質生長 4個階段, 這與 Laptikhovsky和Arkhipkin[3]對巴塔哥尼亞槍烏賊及Hoving和 Laptikhovsky[5]對狼烏賊卵子發生的分期類似。

關于頭足類卵巢發育的分期, 尚未有統一的標準。Perez和Haimovici[28]根據卵巢的厚度、顏色和卵細胞直徑將大愛爾斗蛸(Eledone Massyae)卵巢發育分為了Ⅰ—Ⅳ4個時期, Estefanell等[7]根據性腺指數變化將真蛸卵巢發育也分為了Ⅰ—Ⅳ4個時期,Boyle和 Chevis[6]根據卵黃發生情況, 將尖盤艾爾斗蛸卵巢發育分為了卵黃發生前期、卵黃發生早期、卵黃發生晚期和成熟期4個時期, Gabr等[29]根據卵巢的組織學結構將虎斑烏賊(Sepia pharaonis)和多氏烏賊(Sepia dollfusi)卵巢發育分為未成熟期、成熟期、產卵前期和產卵期 4個時期, 本文根據卵巢的外觀形態、性腺指數變化和切面上各期細胞所占的比例, 將擬目烏賊卵巢發育分為形成前期、形成期、小生長期、大生長期、成熟前期和成熟期6個時期,這種分期方式綜合了形態學、組織學和數據三方面依據, 比較全面, 可作為日后研究頭足類卵巢發育分期的一個參考標準。

3.3 關于濾泡細胞的變化與卵黃的形成

濾泡細胞伴隨著卵母細胞發育的整個過程, 其形態和分布的變化是卵子發生分期的重要依據。關于濾泡細胞的起源, Nakamura[30]、張耀光等[31]和牟振波等[32]均認為濾泡細胞起源于非生殖細胞, 由卵巢基質分化而來, 而Broow[33]和Bolognari等[34]認為濾泡細胞起源于生殖細胞, 由早期卵原細胞分化而來, 在本研究中, 擬目烏賊濾泡細胞和卵原細胞同時出現于卵巢發育的第Ⅰ期, 濾泡細胞形態和大小均不同于卵原細胞, 因而我們認為擬目烏賊濾泡細胞起源于非生殖細胞, 由卵巢基質分化而來。在擬目烏賊卵子發生過程中, 濾泡細胞經歷了一個由包圍卵母細胞的扁平單層, 轉變為外層扁平內層橢圓形的雙層, 內折形成指狀突起, 直至占據整個卵母細胞的網狀結構, 最后解體消失的過程, 這與曼氏無針烏賊[8]和長蛸[10]卵子發生過程中濾泡細胞的變化相類似, 在巴塔哥尼亞槍烏賊[3]卵子發生過程中濾泡細胞經歷了魚鱗狀和圓柱形, 這與本文描述的濾泡細胞經歷了扁平狀和橢圓形是相似的, Selman和 Arnold[2]研究發現皮氏槍烏賊濾泡細胞在卵子發生過程中是逐漸拉長的, Laptikhovsky和Arkhipkin[3]、Hoving 和 Laptikhovsky[5]也得到了類似的結果, 但本研究發現, 擬目烏賊外層扁平濾泡細胞先拉長后縮短, 而內層橢圓形的濾泡細胞直徑變化不大。

關于濾泡細胞的功能, 眾說紛紜, 龔啟祥和杜立勤[35]、張耀光和謝小軍[31]認為濾泡細胞參與卵膜的形成, Grier[36]認為濾泡細胞具有合成和運輸外源性卵黃前體物質的作用, 而Selman和Arnold[2]認為濾泡細胞同時具有合成和分泌卵膜物質和卵黃前體物質的作用, Thiaw和Mattei[37]認為濾泡細胞對退化吸收的卵母細胞還具有二次包裹和吞噬的功能。在本文中, 卵黃的形成與濾泡細胞解體同時發生, 推測濾泡細胞解體前合成了大量卵黃前體物質, 在解體時分泌到卵母細胞中, 從而在短時間內合成了大量卵黃顆粒, 因而我們認為濾泡細胞參與了卵黃的合成,這與Bottke[27]認為卵黃由濾泡細胞產生的觀點一致。

3.4 關于細胞大小的變化

卵細胞的體積在卵子發生過程中發生了較大的變化, 不同物種之間這種變化也不同, 表 2比較了不同物種卵子發生過程中卵細胞直徑的變化, 可看出各個時期卵細胞直徑在不同物種之間具有較大差異, 且在卵子發生過程中, 卵細胞的直徑會出現跳躍性的增長, 曼氏無針烏賊[8]卵細胞跳躍性增長出現在第6—7期, 此期是濾泡細胞大量內折占據整個卵母細胞的時期, 巴塔哥尼亞槍烏賊[3]和狼烏賊[5]卵細胞跳躍性增長出現在第10期, 此期是卵黃大量合成的時期, 擬目烏賊卵細胞出現了兩次跳躍性增長, 第一次出現在第 7期, 即濾泡細胞大量內折期,第二次出現在第 9—10期, 即卵黃大量合成期, 可見濾泡細胞的增長和卵黃的合成是卵細胞體積增長的主要動力。卵子的大小可能會影響精卵的結合以及受精卵的發育, 據悉擬目烏賊受精卵產出時大小為 17.1 mm×39.7 mm, 孵化出的烏賊幼體胴長為8.0 mm, 而曼氏無針烏賊[38]受精卵產出時大小僅有5.5 mm×10.0 mm, 孵化出的烏賊幼體胴長僅有4.0 mm,這與擬目烏賊卵子較曼氏無針烏賊大是密切相關的。

表2 幾種烏賊卵子發生過程中卵細胞直徑變化的比較(單位: μm)Tab. 2 Comparison of oocyte diameter of several cuttlefish during Oogenesis (Unit: μm)

細胞核的變化主要體現在體積和位置上, 在擬目烏賊卵子發生過程中, 細胞核體積不斷增長至第5期, 之后保持在(150—180) μm左右, 位置由細胞中央偏移到一側, 隨著濾泡細胞的解體而逐漸消失,這與皮氏槍烏賊[2]、巴塔哥尼亞槍烏賊[3]和狼烏賊[5]卵子發生過程中細胞核的變化相類似, 而曼氏無針烏賊[8]卵子發生過程中細胞核消失之前體積有一個減小的過程。在整個卵子發生過程中, 核質比是不斷減小的, 這與倪海爾和杜立勤[39]認為卵母細胞越趨向成熟, 核質比越小的觀點一致。