覆盆子酮對HepG2細胞胰島素信號轉導通路中SHP-1和IRS-1表達的影響

楊 浩，謝欣梅，龐曉斌*

(1.河南大學藥物研究所，河南開封 475004;2.河南大學藥學院，河南開封 475004)

糖尿病是近年來發病率逐年攀升的代謝性疾病，高血糖為其主要臨床特征，胰島素絕對或相對缺乏是其基本病理生理改變，因此，降低血糖和改善胰島素抵抗是防治糖尿病及其并發癥的基礎。目前臨床應用的降糖藥主要有磺酰脲類、雙胍類、α-葡萄糖苷酶抑制劑、腸肽類激素 (GLP-1)類似物、胰島素及其類似物等。這些藥物各有局限性，尤其化學類降糖藥存在副作用大等不良反應［1－2］。中醫藥在糖尿病治療中以其副作用小、效果顯著等特點顯示了極大的優勢。

覆盆子酮是中藥覆盆子Rubus chingii Hu果實中的主要成分之一［3］，有研究表明，覆盆子果實富含鞣花酸、超氧化物、糖、黃酮、花青素、多酚類、SOD酶等［4］，現代藥理實驗證明，覆盆子具有抗衰老、抗氧化、防止心血管疾病、降血糖、降血脂等作用，但有關覆盆子酮的降糖作用機制研究較少［5］。本研究以人肝癌細胞系HepG2細胞為研究對象，觀察覆盆子酮對其糖消耗的影響，探討覆盆子酮的降糖作用及其相關機制。

1 實驗材料與主要儀器

1.1 實驗材料 人肝癌細胞株HepG2細胞，中國醫學科學院藥物篩選中心實驗室保存。

藥物及試劑 覆盆子酮 (Raspberry ketone)(浙江新化化工股份有限公司生產，批號為09120012);DMEM培養基 (Gibico公司);胎牛血清 (FBS)、胰蛋白酶 (美國Hyclone公司);血糖測試盒 (氧化酶法)(北京北化康泰臨床試劑有限公司);噻唑藍 (MTT)、羅格列酮、牛胰島素(美國Sigma公司);Trizol、RT-PCR試劑盒 (北京全式金生物技術有限公司);SHP-1、β-actin基因引物 (南京金維智生物技術有限公司合成);兔多克隆抗體IRS-1、β-actin，熒光標記二抗兔抗IgG(美國Cell Signal公司);BCA法蛋白濃度測定試劑盒 (北京平原皓生物技術有限公司)。

1.2 主要儀器 超凈工作臺 (SW-CJ-2FD蘇州凈化設備有限公司);二氧化碳培養箱 (3432Thermo Fisher Scientific);倒置顯微鏡 (ECLIPSE TS100-F NIKON);酶標儀 (SUNRISE-BASIC TECAN Tecan Austria GmbH);凝膠成像系統 (JYO4S-3B北京君意東方電泳設備有限公司)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 人肝癌HepG2細胞用含10%胎牛血清的DMEM低糖培養基在37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養，傳代。

2.2 MTT法測定HepG2細胞活力 取對數生長期HepG2細胞，調節密度為8×103cells/well，接種于96孔細胞培養板，在37℃、5%CO2培養箱中培養至細胞融合度達到80%時，用于實驗。棄上清，加入完全培養基配制的不同濃度覆盆子酮，使其終濃度分別為 1 ×10－6、1 ×10－5、1 ×10－4、1 ×10－3、1 ×10－2、1 ×10－1mol/L。并設空白調零孔(只加DMEM培養基，不加細胞)。每組均設3個復孔，培養24 h，每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL，37℃繼續培養4 h，棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，用酶標儀檢測各孔在490 nm波長下的吸光度 (OD)值，吸光值的高低與細胞活力成正相關性。

2.3 葡萄糖氧化酶法檢測細胞葡萄糖消耗量 取對數生長期的HepG2細胞，以8×103cells/well接種在96孔細胞培養板中，貼壁12 h后，細胞融合度70%，用于葡萄糖消耗實驗。

實驗分為空白組、對照組、覆盆子酮組、羅格列酮陽性對照組 (3×10－5mol/L)。空白組:無細胞，只加入等量培養基;對照組:有細胞，不加藥，只加入等量培養基;覆盆子酮的終濃度分別為1 ×10－8、1 ×10－7、1×10－6、1 ×10－5、1×10－4、1×10－3mol/L。每組設 3個復孔。加藥24 h以葡萄糖氧化酶法檢測培養液上清液中的葡萄糖量。

葡萄糖消耗量 (mmol/L)=預定時間點空白組孔殘余在培養基中的平均葡萄糖量－預定時間點各實驗組殘余在培養基中的葡萄糖量。

2.4 RT-PCR法檢測細胞SHP-1 mRNA基因的表達 取對數生長期的HepG2細胞，以8×104cells/well接種在六孔細胞培養板中，培養24 h后分別加入不同濃度的覆盆子酮，使其終濃度分別為10－6、10－5、10－4mol/L，37 ℃，5% CO2培養48 h。用Trizol試劑提取細胞總RNA。利用 RTPCR試劑盒擴增 SHP-1基因。SHP-1-正向引物:5'-CCTGGAGACTTCGTGCTTT-3'，SHP-1-反向引物:5'-GGCGATGTAGGTCTTAGCG-3'。產物長度為546 bp。β-actin為內參，正向引物:5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，反向引物:5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'，產物長度為186 bp。

擴增條件 β-actin基因:94℃ 5 min，94℃30 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，72℃ 10 min，共38個循環。SHP-1基因:94℃ 5 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 10 min，共38個循環。瓊脂糖凝膠電泳并通過凝膠成像系統檢測SHP-1與β-actin基因表達量。

2.5 Western Blot檢測IRS-1蛋白的表達 收集相應處理后的各組細胞，用預冷細胞裂解液裂解，提取細胞總蛋白。配置10%分離膠和濃縮膠，取30 μg蛋白加入上樣緩沖液，進行SDS-PAGE電泳，轉膜、封閉，加入IRS-1(1∶1000)一抗4℃孵育過夜，TBST洗5次，二抗 (1∶2000)孵育2 h，TBST洗5次，通過 ECL試劑盒進行顯影檢測。

3 實驗結果

3.1 覆盆子酮對HepG2細胞活力的影響 實驗結果顯示，與對照組相比，各劑量的覆盆子酮對HepG2細胞的活力無明顯影響 (P＞0.05)。見圖1。

圖1 覆盆子酮對HepG2細胞活力的影響 (n=3，)Fig.1 Effect of raspberry ketone on cell viability of HepG2 cells(n=3，)

3.2 覆盆子酮對HepG2細胞葡萄糖消耗的影響實驗結果表明，1×10－8～1×10－3mol/L濃度的覆盆子酮作用細胞24 h后，均可促進HepG2細胞葡萄糖消耗量，其中1×10－6～1×10－3mol/L劑量組差異顯著 (P＜0.05)。與對照組相比，1×10－6～1×10－3mol/L劑量組葡萄糖消耗量增加率可達22.41% ～44.63%，1×10－4mol/L劑量組葡萄糖消耗最大 (44.63%)，接近于羅格列酮組(47.96%)。見圖2。

圖2 覆盆子酮對HepG2葡萄糖消耗的影響 (n=3，)Fig.2 Effect of raspberry ketone on glucose consumption in HepG2 cells(n=3，)

3.3 覆盆子酮對HepG2細胞SHP-1 mRNA基因表達的影響 由圖3可知:PCR擴增條帶位置正確:β-actin(186 bp)，SHP-1(546 bp)。與對照組相比，經覆盆子酮作用后，隨覆盆子酮濃度的增加，HepG2細胞SHP-1 mRNA基因表達呈劑量依賴性的明顯降低 (P＜0.01)。見圖3。

3.4 覆盆子酮對HepG2細胞IRS-1蛋白表達的影響 實驗結果顯示，與對照組相比，經覆盆子酮作用后，HepG2細胞 IRS-1蛋白表達量明顯提高(P＜0.01)。并且不同濃度的覆盆子酮呈劑量依賴性的增加IRS-1蛋白表達量。見圖4。

圖3 覆盆子酮對HepG2細胞SHP-1 mRNA表達的影響 (n=3，)Fig.3 Effect of raspberry ketone on mRNA expression of SHP-1 in HepG2 cells(n=3，)

圖4 覆盆子酮對HepG2細胞IRS-1蛋白表達的影響(n=3，)Fig.4 Effect of raspberry ketone on expression of IRS-1 in HepG2 cells(n=3，)

4 討論

糖尿病是目前僅次于腫瘤和心腦血管病的嚴重威脅人類健康的常見病，以高血糖為其主要臨床特征，臨床常用降糖藥物，治療效果各有局限性，尋找治療糖尿病的新藥已成為防治糖尿病的研究熱點。覆盆子酮是中藥覆盆子果實中的主要成分之一。有研究表明，覆盆子具有降血糖、降血脂等作用［5-6］，本研究以人肝癌HepG2細胞為研究對象，探討覆盆子酮的體外降糖作用及其相關機制。實驗結果表明，降糖寧對細胞活力無明顯影響，說明覆盆子酮對人肝癌HepG2細胞無明顯毒性。

葡萄糖消耗實驗是體外實驗中評價藥物是否具有降糖作用的常用方法之一，常用的細胞系有HepG2人肝癌細胞、3T3-L1小鼠脂肪細胞、L6大鼠骨骼肌細胞［7-8］。本實驗選用HepG2人肝癌細胞進行葡萄糖消耗實驗，評價了覆盆子酮對細胞葡萄糖消耗的影響。實驗結果顯示覆盆子酮具有良好的降糖作用，可明顯促進HepG2葡萄糖消耗，1×10－4mol/L劑量組葡萄糖消耗最大 (44.63%)，降糖效果接近于羅格列酮組 (47.96%)。

胰島素受體底物 (IRS-1)與胰島素受體(IR)結合后被磷酸化，參與胰島素介導的信號轉導，是胰島素信號轉導通路的上游蛋白［9-11］。磷酸化的IRS-1通過激活PI3K/AKT通路，進而增加葡萄糖轉運子-4(glucose transporter 4，GLUT4)的膜轉位及轉運葡萄糖能力，促進組織、細胞對葡萄糖的攝取和利用［12-14］。本研究結果表明1×10－6～1×10－4mol/L濃度范圍內的覆盆子酮均能增加HepG2細胞IRS-1蛋白表達量，并且呈劑量依賴性關系，提示覆盆子酮可以促進胰島素信號轉導通路中胰島素受體底物的表達，進而起到降糖作用。

SHP1是體內廣泛表達的胞內蛋白酪氨酸磷酸酶 (PTP)，SHP1和磷酸化的IR和IRS-1結合在一起參與胰島素信號通路的調節［15-16］。SHP1通過與胰島素受體結合并使之去磷酸化，減弱胰島素的活化，進而抑制IRS-PI3K-Akt通路的信號轉導［17］。SHP1缺失，導致胰島素引發的IR、IRS-1和IRS-2的酪氨酸磷酸化水平升高，以及PI3K和Akt的活化［18-19］。因而，通過抑制SHP1在體內的活性，有可能恢復糖尿病病人對血糖的控制能力。本實驗結果表明1×10－6～1×10－4mol/L的覆盆子酮呈劑量依賴性地下調SHP-1 mRNA基因表達量。此結果提示覆盆子酮可能通過抑制HepG2細胞中SHP-1的表達量，增強胰島素信號轉導的磷酸化水平，從而發揮其降糖作用。

綜上所述，覆盆子酮可明顯促進HepG2細胞的葡萄糖消耗。覆盆子酮的降糖作用機制可能與影響胰島素信號通路中IRS-1和SHP-1的表達有關。覆盆子酮對胰島素信號通路中其他靶點的調節作用還需進一步深入研究。

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