炒炭對地榆中鞣質量及止血效果的影響

俞 浩，毛斌斌，劉漢珍

(安徽科技學院食品藥品學院，安徽蚌埠 233100)

地榆為薔薇科植物地榆Sanguisorba officinalis L.或長葉地榆 Sanguisorba of ficinalis L.var.Longifolia(Bert.)Yü et Li的干燥根，具有涼血止血，解毒斂瘡之功效，主要用于便血、痔血、血痢、崩漏、水火燙傷、癰腫瘡毒等證［1］。研究表明，地榆具有抗炎消腫、止血、抗氧化、抗腫瘤、抗菌等多種藥理作用［2-5］。地榆供臨床應用有生地榆和地榆炭兩個炮制品種，其中生地榆涼血止血，尤以涼血作用較強;地榆炭止血、收斂、止痢作用較生地榆顯著增強［1］。當前，有關地榆炮制后鞣質含有量變化結果不一。本實驗以安徽滁州產長葉地榆為研究對象，采用《中國藥典》規定的炮制方法進行炮制，觀察地榆炒炭前后鞣質的變化，并觀察炮制對地榆止血作用的影響，對地榆炒炭止血合理性進行探討。

1 材料

1.1 藥品與試劑 地榆，采自安徽省鳳陽縣韭山，經安徽科技學院劉漢珍副教授鑒定為長葉地榆Sanguisorba officinalis L.var.longifolia(Bert.)Yü et Li的干燥根;沒食子酸(北京儀化通標科技有限公司);干酪素 (上海諾泰化工有限公司);亞甲基藍 (天津市科密歐化學試劑開發中心);凝血酶原時間、凝血酶時間、活化部分凝血活酶時間和纖維蛋白原測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 主要儀器設備 TU1810型紫外可見分光光度計 (北京普析通用儀器公司);TDL-5離心機 (上海安亭科學儀器廠);數顯恒溫水浴鍋 (常州國華電器有限公司);ACL200全自動血凝分析儀 (BECKMANH);體外血栓形成血小板粘附兩用儀 (北京宏潤達科技發展有限公司);FA21048電子天平 (上海市精密科學儀器總廠)。

1.3 實驗動物 昆明種小鼠，體質量 (20±2)g，雌雄各半，由安徽醫科大學實驗動物中心提供，合格證號為:SCXK(皖)2007-001;SD大鼠，體質量 (200±20)g，雌雄各半，由安徽省實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(皖)2011-002號。

2 方法

2.1 地榆炮制品的制備［6］生地榆:取地榆，洗凈，除去殘莖，潤透，切厚片，干燥即得。地榆炭:取凈地榆片，置熱鍋內，用武火炒至表面焦黑色，內部棕褐色，噴淋清水少許，熄滅火星，取出，晾干，得地榆炭。生地榆和地榆炭打成粗粉備用。

2.2 鞣質測定［6］

2.2.1 沒食子酸對照品溶液的配制 精密稱取沒食子酸對照品10 mg，置200 mL棕色量瓶中，蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，得質量濃度為0.05 mg/mL的沒食子酸對照品溶液，備用。

2.2.2 標準曲線的制備 精密量取沒食子酸對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置25 mL棕色量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液1 mL，再分別加水至13 mL，用29%Na2CO3溶液稀釋并定容，搖勻，放置30 min。以相應試劑做空白，760 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，質量濃度為橫坐標，得標準曲線方程為 Y=85.0630X+0.0078，r2=0.9990，在 1 ～10 μg/L 范圍內線性關系良好。

2.2.3 檢測樣品溶液的制備 精密稱定生地榆或地榆炭粗粉1 g，置250 mL棕色量瓶中，加蒸餾水150 mL，放置過夜，超聲處理10 min，放冷，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，靜置，濾過，棄去初濾液，精密量取續濾液20 mL，置100 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，待測。

總酚測定 精密量取檢測樣品溶液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液1 mL，加水10 mL，余步驟同“2.2.2”項下方法，計算沒食子酸的量。

不被吸附多酚測定 精密稱定干酪素0.6 g，置100 mL具塞錐形瓶中，加入檢測樣品溶液25 mL，密塞，置30℃恒溫水浴搖床振蕩1 h，取出，放冷，搖勻，濾過，棄去初濾液，取續濾液。精密量取續濾液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液1 mL，加水10 mL，余步驟同“2.2.2”項下方法，計算沒食子酸量。鞣質量=總酚量－不被吸附的多酚量。

2.3 地榆炒炭前后吸附力測定［7-8］

2.3.1 亞甲基藍標準溶液的配制 精密稱取烘干至恒定質量的亞甲基藍對照品40 mg，置500 mL的量瓶中，用pH7的磷酸緩沖液溶解并定容，得質量濃度為0.04 mg/mL的亞甲基藍對照品溶液。

2.3.2 亞甲基藍標準曲線的制備 精密量取亞甲基藍對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置25 mL量瓶中，用pH7的磷酸鹽緩沖液定容，搖勻。以相應的空白試劑作對照，670 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，亞甲基藍質量濃度橫坐標，得標準曲線方程為Y=0.06489X+0.0018，r2=0.9998，在 0.8 ～8.0 μg/mL 范圍內線性關系良好。

2.3.3 吸附力測定 精密稱取生地榆和地榆炭粉末各0.1 g，置100 mL具塞錐形瓶中，分別加入亞甲基藍標準溶液25 mL，置水浴恒溫振動器上振蕩120 min，濾過，取濾液。以磷酸緩沖溶液為空白對照，在670 nm處測定吸光度，計算吸附量和吸附力。吸附量=加入量－未被吸附量，吸附力=吸附量/樣品量。

2.4 地榆炒炭前后止血凝血作用研究

2.4.1 地榆供試液的制備 稱取生地榆或地榆炭50 g，分別加水500 mL，浸泡 8 h，武火煮沸，文火保持微沸30 min，過濾，取濾液，濃縮至100 mL，得質量濃度為0.2 g生藥/mL的地榆或地榆炭水提液。試驗時以生理鹽水稀釋至所需質量濃度。

地榆、地榆炭人臨床用量為15 g，按60 kg體質量計，以生藥量折算小鼠的等效劑量為2.25 g/kg體質量，大鼠等效劑量為1.75g/kg體質量。

2.4.2 地榆炒炭對小鼠出血時間的影響［7］取小鼠60只，隨機分成6組，即生地榆高、低劑量組 (劑量分別為4.5、2.25 g/kg)，地榆炭高、低劑量組 (劑量分別為4.5、2.25 g/kg)，云南白藥組 (劑量為0.4 g/kg)和空白對照組。灌胃給藥，每日1次，連續7 d，灌胃容量均為20 mL/kg，空白對照組給等容量的生理鹽水。末次給藥后1 h，在距小鼠尾尖1 cm處用剪刀剪斷尾尖，立即開始計時，并每隔30 s用濾紙擦拭斷尾處1次，至濾紙上無血跡為止，記錄出血時間。

2.4.3 地榆炒炭對小鼠凝血時間的影響［9-10］取小鼠60只，隨機分成6組，即生地榆高、低劑量組 (劑量分別為4.5、2.25 g/kg)，地榆炭高、低劑量組 (劑量分別為4.5、2.25 g/kg)，云南白藥組 (劑量為0.4 g/kg)和空白對照組。灌胃給藥，每日 1次，連續 7 d，灌胃容量均為20 mL/kg，空白對照組給等容量的生理鹽水。末次給藥后1 h，小鼠眶后靜脈叢采血，滴一滴血于潔凈的載玻片上，立即計時，并每隔30 s用注射針頭挑動1次，至有凝血絲出現時止，記錄凝血時間。

2.4.4 地榆炒炭對大鼠體外血栓形成及凝血參數的影響［11-12］取大鼠60只，隨機分成6組，即生地榆高、低劑量組 (劑量分別為3.5、1.75 g/kg)，地榆炭高、低劑量組(劑量分別為3.5、1.75 g/kg)，云南白藥組 (劑量為0.3 g/kg)和空白對照組。灌胃給藥，每日1次，連續7 d，灌胃容量均為5 mL/kg，空白對照組給等容量的生理鹽水。

2.4.4.1 體外血栓長度和干、濕質量測定 末次給藥后30 min，戊巴比妥鈉 (劑量為30 mg/kg)麻醉大鼠，仰位固定，腹主動脈取血，取2 mL血液注入血栓管，立即將血栓管固定于體外血栓形成血小板粘附兩用儀上，開啟儀器，轉動15 min，取下血栓管，將血栓倒在濾紙上，吸凈血栓表面余血，測量血栓長度 (cm)，稱血栓濕重。然后將血栓置64℃烘箱內干燥30 min，取出，稱血栓干重。

2.4.4.2 凝血參數測定 大鼠腹主動脈采血，3.8%枸櫞酸鈉抗凝 (枸櫞酸鈉∶全血為1∶9，V/V)，取抗凝血，按照試劑盒說明書操作方法，采用全自動血凝儀測定凝血酶原時間、活化部分凝血酶時間、凝血酶時間和纖維蛋白原含量。

3 結果

3.1 地榆炒炭前后鞣質的量及吸附力測定結果 由表1可知，生地榆鞣質含有量為8.92%，吸附力為0.98 mg/g，炒炭后鞣質含有量為11.16%，吸附力為1.41 mg/g。說明地榆炒炭后鞣質量增加，吸附力增強。

表1 地榆炒炭前后鞣質及吸附力測定結果 (n=5)

3.2 地榆炒炭對小鼠出血時間和凝血時間的影響 由表2可知，生地榆和地榆炭均能顯著縮短小鼠的出血時間和凝血時間，與空白對照組比較具有顯著性差異 (P＜0.01);地榆炭高、低劑量組小鼠的出血時間和凝血時間均顯著低于相應劑量的生地榆 (P＜0.05或P＜0.01)。說明地榆具有很好的止血作用，炒炭后止血作用增強。

表2 地榆炒炭對小鼠出血時間和凝血時間的影響 (x ± s，n=10)

3.3 地榆炒炭對大鼠體外血栓長度和干、濕重的影響 由表3可知，生地榆高劑量組和地榆炭高、低劑量組大鼠血栓長度均顯著高于空白對照組，差異具有顯著性意義(P＜0.05或P＜0.01)，地榆炭的作用顯著強于同等劑量的生地榆 (P＜0.05);生地榆和地榆炭均能顯著增加大鼠血栓濕重和干重，與空白對照組比較具有顯著性差異(P＜0.05)，地榆炭的作用顯著強于同等劑量的生地榆(P＜0.01)。說明生能顯著促進大鼠體外血栓的形成，炒炭后促進血栓形成作用更強。

表3 地榆炒炭前后對大鼠體外血栓長度和干、濕重的影響 (，n=10)

表3 地榆炒炭前后對大鼠體外血栓長度和干、濕重的影響 (，n=10)

注:與空白對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與同等劑量的地榆炭比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

/g空白對照組 —組 別 劑量/(g·kg－1) 血栓長度/cm 血栓濕重×10－2/g 血栓干重×10－2 2.59±0.37 12.43±1.38 3.38±0.80云南白藥組 0.3 3.58±0.56＊＊ 18.53±2.16＊＊ 4.99±0.54＊＊生地榆高劑量組 3.5 3.08±0.44＊△ 15.90±1.44＊＊△△ 4.06±0.58＊△△生地榆低劑量組 1.75 2.78±0.44△ 15.22±1.70＊＊△△ 3.97±0.37＊△△地榆炭高劑量組 3.5 3.54±0.54＊＊ 18.26±1.10＊＊ 4.86±0.71＊＊地榆炭低劑量組 1.75 3.22±0.43＊＊ 17.73±1.04＊＊ 4.43±0.56＊＊

3.4 地榆炒炭對大鼠凝血參數的影響 由表4可知，生地榆和地榆炭均能顯著降低凝血原時間，與空白對照組比較具有顯著性差異 (P＜0.01)，地榆炭的作用顯著強于同等劑量的生地榆 (P＜0.01);生地榆高劑量和地榆炭高、低劑量均能顯著升高纖維蛋白原含量，與空白對照組比較具有顯著性差異 (P＜0.05或P＜0.01)，地榆炭的作用顯著強于同等劑量的生地榆 (P＜0.05或P＜0.01);生地榆和地榆炭均能顯著縮短活化部分凝血酶時間和凝血酶時間，與空白對照組比較具有顯著性差異 (P＜0.01)，地榆炭高劑量作用顯著強于生地榆高劑量 (P＜0.05)。說明具有促進凝血作用，炒炭后凝血作用增強。

表4 地榆炒炭對大鼠凝血參數的影響 (，n=10)

表4 地榆炒炭對大鼠凝血參數的影響 (，n=10)

注:與空白對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與同等劑量的地榆炭比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

/s空白對照組 —組 別 劑量/(g·kg－1) 凝血酶原時間/s 纖維蛋白原/(g·L－1) 活化部分凝血酶時間/s 凝血酶時間13.32±1.38 6.86±0.91 27.75±3.96 19.17±1.88云南白藥組 0.3 9.40±0.70＊＊ 10.41±1.12＊＊ 20.13±1.70＊＊ 14.32±2.58＊＊生地榆高劑量組 3.5 11.08±0.52＊＊△△ 7.90±0.90＊△ 23.32±2.33＊＊△ 16.34±1.44＊＊△生地榆低劑量組 1.75 11.48±0.97＊＊△△ 7.23±0.75△△ 24.27±2.29＊＊ 16.59±1.25＊＊地榆炭高劑量組 3.5 9.85±0.73＊＊ 9.12±0.79＊＊ 20.83±2.13＊＊ 14.42±1.95＊＊地榆炭低劑量組 1.75 10.60±0.98＊＊ 8.60±1.65＊＊ 22.09±2.83＊＊ 15.61±1.86＊＊

4 討論

中藥炒炭供臨床應用是我國醫藥學的一大特色，炒炭的目的是使藥物增強或產生止血作用，即“炒炭止血”理論。地榆為中醫臨床常用的止血藥之一，清《本草分經》謂“止血炒黑用”［13］。鞣質具有收縮創面微血管，并能與創面滲出物中的蛋白質結合形成大分子，使創傷組織表面蛋白凝固，減少分泌與血漿滲出，并可在血管破損處形成硬塊而發揮止血作用，由此可見，鞣質是中藥止血的主要成分之一。當前，關于地榆炒炭后鞣質變化及止血效果的研究報道較多，但結果存在較大差異。有研究認為，地榆炒炭后鞣質含有量下降［14-15］。也有研究結果顯示，地榆炒炭后鞣質含量增加，且能縮短小鼠出血時間［16-18］。

本實驗采用《中國藥典》2010年版規定方法制備了生地榆和地榆炭兩個炮制品種，探討了地榆炮制前后鞣質和吸附力的變化，觀察了地榆炮制前后對小鼠出血時間和凝血時間的影響，并觀察了對大鼠體外血栓形成和凝血參數的影響。實驗結果顯示，地榆炒炭后與收斂止血功效相關的成分鞣質含有量升高，吸附力增強;地榆炭組小鼠的出血時間和凝血時間均顯著低于生地榆組;地榆炭能夠抑制大鼠體外血栓的形成，縮短凝血酶原時間、凝血酶時間和活化部分凝血酶時間，升高纖維蛋白原含量，說明地榆炒炭后止血作用增強。本實驗從地榆炒炭后鞣質含有量和止血效果變化揭示了地榆炒炭止血的合理性。有關地榆炒炭止血的機制及是否僅與鞣質的量的增加有關有待進一步深入研究。

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