山銀花黃酮粗提物抗氧化活性的體外觀察

徐望龍，李云貴，孫林軍，唐勵靜，謝雁飛，郭 玉*

(1.南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南衡陽 421001;2.南華大學(xué)船山學(xué)院，湖南衡陽 421001;3.婁底市中心醫(yī)院，湖南婁底 417000)

山銀花Lonicerae Flos為忍冬科植物灰氈毛忍冬Lonicera macrathoides Hand.-Mazz.、紅腺忍冬 Lonicera hypoglauca Miq.、華南忍冬Lonicera confusa DC.或黃褐毛忍冬Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或帶初開的花［1］。忍冬科植物中的黃酮類化合物種類豐富［2］，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤、抗炎癥、抗突變、抗過敏、降血脂等［3-4］。山銀花為臨床常用中藥，具有清熱解毒、涼散風熱的功效，常用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫病發(fā)熱等癥［5］，其黃酮化合物的抗氧化活性目前尚未見報道。本研究采用70%乙醇浸提與超聲波相結(jié)合的方法提取山銀花總黃酮，并采用清除O2－·、·OH和DPPH·的效果及對氧化損傷的內(nèi)皮細胞和心肌細胞的保護作用，體外觀察山銀花中黃酮類化合物的抗氧化活性，為山銀花黃酮類化合物的進一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 新鮮山銀花采摘于湖南省邵陽市隆回縣，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院鑒定。用蒸餾水洗凈置于60℃烘箱中干燥，粉碎、過40目藥篩，制得山銀花干粉，密封保存，備用。

1.1.2 試劑 蘆丁對照品 (批號100416-201004，中國食品藥品檢定研究院);鄰二氮菲 (分析純，大茂化學(xué)試劑廠)，鄰苯三酚 (分析純，博迪化工股份有限公司)，H2O2(分析純，西隴化工股份有限公司)，Tris(分析純，Aladdin Chemistry Co.Ltd)，DPPH(Purity，TCI)，DMSO(分析純，Amresco)，維生素 C(生物級，購于 Fluka公司);MTT(分析純，Aladdin Chemistry Co.Ltd)，其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器 UV-2540(日本島津公司);FA224型電子天平 (上海舜宇恒平科學(xué)儀器公司);SB-5200DTDN型超聲波清洗儀 (寧波新芝生物科技公司);FW100高速萬能粉碎機 (天津市泰斯特儀器公司);BIO-TEK酶標儀(ELX800，美國);SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵 (予華儀器有限責任公司);RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (予華儀器有限責任公司);Freezer Dryer(FD5-2.5，Gold SIM International Group Co.Ltd);HYQ-3110渦旋混勻器 (Crystal Industries，America)。

1.2 方法

1.2.1 黃酮粗提取物的制備 稱取50.0 g山銀花粉末，浸于70%乙醇溶液中，先超聲 (60℃、200 W)提取5 min，再回流提取30 min，同法提取3次，合并3次提取液，減壓回收乙醇，濃縮至15 mL左右時移入提前稱好質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，冷凍干燥得到黃酮粗提取物，稱重，計算提取率。

1.2.2 蘆丁標準曲線的繪制 分別取0.2 mg/mL蘆丁對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于6只25 mL量瓶中，加入5%NaNO21.0 mL，搖勻，放置6 min后加入10%Al(NO3)3溶液1.0 mL和1.0 mol/L NaOH溶液10.0 mL，混勻，用蒸餾水稀釋至刻度，15 min后以第一管作空白參比，在510 nm波長處測定吸光值;以吸光值A(chǔ)為縱坐標、質(zhì)量濃度C為橫坐標繪制標準曲線［6］。

1.2.3 山銀花黃酮定量測定 準確稱取黃酮粗品100.0 mg，加入70%的乙醇溶液，搖勻，定容至100 mL，得到樣品液。精密吸取1.0 mL樣品液置于25 mL量瓶中，后續(xù)步驟同“1.2.2”項，測定吸光值;由回歸方程計算粗提物中黃酮的含有量。

在輪滑運動教學(xué)中，教師應(yīng)該指導(dǎo)學(xué)生學(xué)會正確的摔倒方式，使其在發(fā)生摔倒事件時能夠?qū)⑸眢w的損傷程度降到最低。輪滑教師要指導(dǎo)學(xué)生在摔倒時候應(yīng)該盡量保持冷靜，努力將自身的膝蓋先行著地，之后是手肘，最后是手掌，以此來減少身體與地面的接觸面積。在摔倒時候避免身體部位直接與地面接觸而產(chǎn)生嚴重的身體損傷，在向前摔倒時應(yīng)將頭部向后仰，向后摔倒時應(yīng)將頭部向前仰，盡量避免傷害到頭部。

1.3 抗氧化活性測定

1.3.1 山銀花黃酮粗提物對O－2·的清除作用 取質(zhì)量濃度為0、50、100、150、200、250 μg/mL黃酮粗提物溶液各2.0 mL，分別加4.5 mL Tris-HCl溶液 (0.05 mol/L，pH 8.2)和2.2 mL雙蒸水，室溫水浴20 min，再加鄰苯三酚溶液 (3.0 mmol/L)0.3 mL，迅速混勻于420 nm處測吸光值A(chǔ)，每30 s測1次，以雙蒸水調(diào)零，質(zhì)量濃度為0管用于計算鄰苯三酚溶液的自身氧化速率，計算O－2·清除能力［7］。

公式:清除率 (%)=(A0－A樣)/A0×100%。

其中:A0，樣品質(zhì)量濃度為0管的吸光值;A樣，樣品管的吸光值。

1.3.2 山銀花黃酮粗提物對·OH的清除作用 取2.0 mL鄰二氮菲溶液 (7.5 mmol/L)和4.0 mL磷酸緩沖液 (pH 7.4)7份 (1～7號)分別加入黃酮粗提物溶液 (0、0、50、100、150、200、250 μg/mL)2.0 mL，充分搖勻后加2.0 mL硫酸亞鐵(0.75 mmol/L)和2.0 mL H2O2(0.01%，其中1號0管以雙蒸水代替 H2O2)，搖勻，37℃水浴60 min后536 nm檢測吸光值A(chǔ)，并以雙蒸水調(diào)零。計算·OH的清除率［7］。

公式為:清除率 (%)=(A樣－A空)/(A0－A空) ×100%。

其中:A0，1號0管的吸光值;A樣，樣品管的吸光值;A空，2號0管的吸光值。

公式為:清除率 (%)=(A空－A樣)/A空×100%。

其中:A空，質(zhì)量濃度為0管的吸光值;A樣，樣品管的吸光值。

1.3.4 山銀花黃酮粗提物對內(nèi)皮細胞和心肌細胞的抗氧化保護作用 用1.0 mmol/L H2O2與內(nèi)皮細胞和心肌細胞共同孵育12 h復(fù)制氧化損傷模型，以維生素C為陽性抗氧化藥物，用MTT法篩選建立氧化損傷模型的H2O2最佳濃度和抗氧化損傷的維生素C最佳濃度，測定波長為490 nm。同理，用MTT法檢測不同質(zhì)量濃度山銀花黃酮粗提物預(yù)處理30 min對內(nèi)皮細胞和心肌細胞氧化損傷的保護作用［9，10］。

2 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 蘆丁標準曲線與回歸方程 蘆丁質(zhì)量濃度C與吸光值A(chǔ)的關(guān)系經(jīng)線性回歸分析，得回歸方程為A=0.2406C－0.1252，r=0.9991。說明蘆丁質(zhì)量濃度在8～40 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

3.2 山銀花黃酮粗提物的提取率與含有量 70%乙醇浸提結(jié)合超聲波法，從50.0 g山銀花粉末中提取得到總黃酮粗品質(zhì)量為2.8254 g，其提取率為5.65%;根據(jù)測定粗提物的吸光度值，按標準曲線法，計算得到粗提物中總黃酮的含有量為16.35%。

3.3 山銀花黃酮粗提物抗氧化活性實驗結(jié)果

圖1 山銀花黃酮粗提物對·、·OH及DPPH·的清除效果

3.3.2 山銀花黃酮粗提物對內(nèi)皮細胞和心肌細胞的抗氧化保護作用 內(nèi)皮細胞和心肌細胞與濃度1.0 mmol/L的H2O2共同孵育12 h后，細胞的形態(tài)和活性明顯變化，其存活率分別下降到49.21%和61.32%。不同質(zhì)量濃度的黃酮粗提物對不同類型的細胞氧化損傷的保護作用結(jié)果見表1。中、低質(zhì)量濃度對內(nèi)皮細胞有較強的抗氧化保護作用，而高質(zhì)量濃度黃酮保護作用不明顯，推測可能高質(zhì)量濃度黃酮對該細胞產(chǎn)生了一定的毒性。在心肌細胞中，黃酮對該細胞的抗氧化保護作用呈劑量依賴性，高質(zhì)量濃度組對心肌細胞的保護效果強于中質(zhì)量濃度組，且兩個質(zhì)量濃度都有顯著的保護作用，而低質(zhì)量濃度組保護作用不明顯。陽性對照組維生素C對內(nèi)皮細胞的抗氧化保護作用明顯高于保護效果最好的中質(zhì)量濃度黃酮組，而對心肌細胞的抗氧化保護作用同高質(zhì)量濃度的黃酮組相當。

4 討論

黃酮是一類多酚類化合物，多具抗氧化活性，能直接清除機體的自由基，抑制還原型輔酶Ⅱ (NADPH)氧化酶的活性，抑制活性氧 (ROS)的產(chǎn)生，減少氧化應(yīng)激。研究表明，黃酮類化合物具有抗高血壓、抗癌、明顯降低心血管疾病的死亡率等［9-10］。目前，有文獻報道了忍冬科金銀花中黃酮類化合物的提取及抗氧化活性的研究，但是，對資源豐富的山銀花黃酮類化合物抗氧化活性的研究尚未見報道。謝學(xué)明等［11］的研究證實華南忍冬的乙醇提取物對DPPH·有很強的抗氧化活性。王柳萍等［12］對廣西紅腺忍冬和山東忍冬的總黃酮提取物的抗氧化作用進行了研究，結(jié)果為山東忍冬的抗氧化活性比廣西紅腺忍冬的抗氧化活性較強，說明不同地區(qū)的忍冬科植物的總黃酮提取物的抗氧化能力也有差異。現(xiàn)代研究證實，忍冬科的金銀花黃酮類成分具有清除人體·、抗衰老、改善血管功能和提高機體免疫力等重要作用［13］;能抑制燙傷小鼠中性粒細胞釋放過氧化氫，減少中性粒細胞合成和釋放溶酶體酶［14］，對油脂的過氧化反應(yīng)也有明顯的抑制作用。

表1 山銀花黃酮粗提物對內(nèi)皮細胞和心肌細胞的影響 (n=6)

山銀花也屬忍冬科植物，與金銀花極為相似，原材料來源卻極為廣泛。本實驗以70%乙醇結(jié)合超聲波法提取山銀花總黃酮的操作程序簡單、方便、安全，提取效率高以及提取物保留著較高的生物學(xué)活性等優(yōu)點。本實驗觀察到山銀花黃酮具有較強的清除自由基能力，并且對氧化損傷的內(nèi)皮細胞和心肌細胞具有較好的抗氧化保護作用。自由基的性質(zhì)活潑，氧化能力強，極易攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，并引發(fā)脂自由基過氧化鏈式反應(yīng)，從而導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)和功能受到不可逆性損傷，這可能是誘發(fā)多種疾病的發(fā)病機制［13，15］。研究報道，氧化損傷在血管內(nèi)皮細胞功能障礙和心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起很重要的作用［15］，還導(dǎo)致動脈粥樣硬化、糖尿病、腫瘤等疾病的發(fā)生［16］。心血管疾病是全世界主要致死致殘的主要原因之一，且內(nèi)皮細胞和心肌細胞氧化損傷是涉及心血管疾病的兩大主要因素。

山銀花黃酮類化合物抗氧化作用的研究還處于初級階段，尚未深入到分子機理水平，臨床運用也僅作為一味中藥使用，黃酮類化合物在體內(nèi)的吸收和代謝規(guī)律等也有待進一步研究。

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