刺五加多糖對人宮頸癌HeLa細(xì)胞體外增殖和凋亡作用的實(shí)驗(yàn)研究

靳 祎，劉 超，范林林，胡亞楠，盧雪崢，王恩軍

(1.河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北保定 071000;2.保定市第一中心醫(yī)院，河北保定 071000;3.保定市兒童醫(yī)院，河北保定 071000)

中藥刺五加Acanthopanax senticosus為五加科植物，其根、莖、葉均可入藥，具有扶正固本、補(bǔ)腎安神的功效［1-2］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)刺五加具有提高免疫、延緩衰老、抑制血栓形成和抗腫瘤等作用［3］。刺五加中含有的主要活性成分是刺五加苷和多糖［4］，近年來，隨著多糖分離技術(shù)的不斷成熟，其多糖活性也得到了進(jìn)一步驗(yàn)證。大量研究表明刺五加多糖具有很好的抗腫瘤作用［5］，具有巨大的開發(fā)潛能。本研究初步證實(shí)了刺五加多糖抗人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖及促凋亡作用，并探討其機(jī)制，為其應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

腫瘤細(xì)胞株HeLa 由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。刺五加多糖原生藥從河北安國縣藥材公司購買;采用熱水浸提法［6］提取，通過苯酚-硫酸法檢測含多糖量為75.12%，試驗(yàn)前用生理鹽水配置成500 mg/mL的溶液。

1.2 試劑 胰蛋白酶和RPMI-1640培養(yǎng)液購自GIBCO公司，二甲基亞砜 (DMSO)、四甲基偶氮唑鹽 (MTT)購自Sigma公司，順鉑為齊魯制藥有限公司產(chǎn)品，瓊脂糖購自北京拜爾迪生物公司，溴化乙錠為研生生化試劑有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞抑制試驗(yàn) (MTT法) 將密度為2×104個/mL的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，貼壁生長24 h后用于試驗(yàn)。分兩組，對照組加入生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組加入不同質(zhì)量濃度的刺五加多糖 (分別為1、2、4、8、16 mg/mL)，48 h后加入MTT液，DMSO溶解，震蕩，酶標(biāo)儀測定490 nm波長下各孔的吸光度值 (A490)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率和半數(shù)抑制濃度 (IC50)。

1.3.2 細(xì)胞凋亡的檢測

1.3.2.1 DNA瓊脂糖凝膠電泳 取2瓶對數(shù)生長期的細(xì)胞，密度為5×108個/mL，分兩組，對照組加生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組加1.8 mg/mL的刺五加多糖，48 h后收集細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液，蛋白酶K，然后經(jīng)飽和酚、三氯甲烷/異戊醇多次抽提DNA，加醋酸鈉、無水乙醇沉淀DNA，75%乙醇漂洗。在2%瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣，1xTBE的電泳緩沖液電泳，紫外透射儀觀察梯形條帶并拍照。

1.3.2.2 促凋亡蛋白Bax的表達(dá) 采用免疫組化過氧化酶標(biāo)記的鏈霉卵白素 (streptavidin peroxidase，SP)法，爬片經(jīng)4%多聚賴氨酸預(yù)處理。細(xì)胞密度為2×105個/mL，培養(yǎng)24 h后，加入終質(zhì)量濃度為1.8 mg/mL的刺五加多糖，培養(yǎng)48 h后，丙酮固定，血清封閉，滴加一抗、二抗工作液，辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察、攝片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)用表示，組間比較使用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖的抑制作用 HeLa細(xì)胞在不同質(zhì)量濃度的刺五加多糖作用下，增殖明顯受到抑制，A490值均下降，與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，表1)，而且細(xì)胞抑制率隨藥物劑量增大而增強(qiáng)。通過MTT法作出的細(xì)胞生長曲線可以得出Hela細(xì)胞生長受抑制50%時(shí)的藥物濃度即半數(shù)抑制濃度IC50為1.8 mg/mL(48 h)。

表1 不同質(zhì)量濃度的刺五加多糖對HeLa細(xì)胞增殖的抑制率(n=4，)

表1 不同質(zhì)量濃度的刺五加多糖對HeLa細(xì)胞增殖的抑制率(n=4，)

注:與對照組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組 別 質(zhì)量濃度/(mg·mL－1)A490 HeLa細(xì)胞抑制率/%－ 0.847±0.002 －刺五加多糖組 1 0.533±0.005＊＊ 37.04±0.17刺五加多糖組 2 0.378±0.009＊＊ 55.36±0.14刺五加多糖組 4 0.255±0.010＊＊ 69.85±0.15刺五加多糖組 8 0.097±0.003＊＊ 88.56±0.21刺五加多糖組 16 0.048 ±0.011＊＊對照組94.36±0.20

2.2 凋亡細(xì)胞的凝膠電泳 對照組細(xì)胞DNA呈現(xiàn)一個高分子量條帶，位于膠的頂部。刺五加多糖組細(xì)胞DNA呈現(xiàn)凋亡特異的降解片段，稱為“DNA Ladder”(見圖1)，表明刺五加多糖可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖1 細(xì)胞的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜

2.3 細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá) Bax蛋白定位于胞漿，陽性產(chǎn)物染色呈棕黃色。在刺五加多糖的作用下，細(xì)胞中Bax表達(dá)明顯升高 (圖2)。由此說明，細(xì)胞的凋亡與Bax表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。

圖2 細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá) (SP，400×)

3 討論

宮頸癌是女性第二大高發(fā)惡性腫瘤，臨床治療主要采用手術(shù)、放化療等方法［7］。目前，隨著研究的深入，抗宮頸癌的藥物也由傳統(tǒng)細(xì)胞毒性藥物轉(zhuǎn)向?yàn)槎喟悬c(diǎn)、多機(jī)制的藥物。天然中草藥在宮頸癌的治療方面有著很好的應(yīng)用前景。近些年，有關(guān)中藥及其有效成分的抗腫瘤作用研究也取得了重大成果，通過直接細(xì)胞毒作用、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制端粒酶活性、抗腫瘤血管生成、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等多種機(jī)制起作用。研究表明，很多中藥對宮頸癌有很好的抑制效果，而且一些單藥提取物已應(yīng)用于臨床［8］。

刺五加屬五加科，是草藥刺五加的原植物。多年來，很多學(xué)者對刺五加的化學(xué)成分及藥理作用進(jìn)行了大量的研究，證實(shí)了刺五加的活性成分及其良好的藥理作用。其中抗腫瘤作用作為刺五加研究中的一個熱點(diǎn)備受關(guān)注［9-10］。研究表明:刺五加對多種腫瘤，如藥物誘發(fā)性腫瘤、移植性腫瘤、腫瘤轉(zhuǎn)移及小白鼠自發(fā)性白血病均有一定的抑制作用。且刺五加多糖對小鼠肉瘤 S180細(xì)胞、人白血病K562細(xì)胞體外增殖有較強(qiáng)的抑制作用，能抑制腫瘤生長，適于用作抗癌輔助藥品［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)刺五加多糖對體外培養(yǎng)的Hela細(xì)胞增殖有很強(qiáng)的抑制作用，抑制率隨其質(zhì)量濃度增大而增強(qiáng)，顯示較好的劑量依賴關(guān)系。刺五加多糖對Hela細(xì)胞的IC50為1.8 mg/mL。

腫瘤的發(fā)生不但涉及細(xì)胞的異常增殖和分化，并且與細(xì)胞凋亡受阻有關(guān)［12］。很多藥物的抗癌機(jī)理都是誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的凋亡［13］。細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡，它參與腫瘤發(fā)生的起始，并對腫瘤的發(fā)生起負(fù)相調(diào)控作用，涉及到一系列基因的調(diào)控。Bax是目前研究最廣泛且最深入的促凋亡基因之一［14］。很多報(bào)道顯示Bax蛋白在宮頸癌的發(fā)展中表達(dá)逐漸缺失，促進(jìn)了細(xì)胞癌變［15］。本實(shí)驗(yàn)中刺五加多糖作用 Hela細(xì)胞后，提取的DNA出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的典型特征，有DNA Ladder凋亡條帶出現(xiàn)，說明刺五加多糖可以誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡，并且Bax蛋白在多糖作用細(xì)胞后表達(dá)水平明顯增加，證實(shí)Bax蛋白在Hela細(xì)胞凋亡過程中起到了促凋亡作用，增加了宮頸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)會。以上結(jié)果表明，刺五加多糖是通過抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)增強(qiáng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用的。

刺五加多糖的抗腫瘤作用機(jī)制復(fù)雜，是否還存在其他的作用機(jī)制有待于今后研究進(jìn)一步闡明，相信隨著對刺五加多糖研究的深入及其作用機(jī)制的揭示，必將對刺五加多糖應(yīng)用于宮頸癌的臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

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