正交試驗法優選土家藥夜關門中D-松醇提取工藝

郜紅利，張 方

(1.湖北民族學院中醫藥學院，湖北恩施 445000;2.恩施自治州優撫醫院，湖北恩施 445000)

夜關門為豆科植物截葉鐵掃帚Lespedeza cuneata(Dum.Cours.)G.Don的全草，以其白天葉子迎陽張開，傍晚自然合攏，故而在土家族稱為“夜關門”［1］。夜關門作為土家苗藥的珍貴藥材，其性微溫，味辛微苦，具有散瘀消腫，補肝益肺，安神之功效，可用于治療遺精、哮喘、跌打損傷、失眠等［2-7］。現代研究表明，夜關門中含有黃酮類化合物、D-松醇、木質素、松腦、酚性成分、鞣質、含羞草堿和含羞草苷等［8］。

D-松醇 (右旋肌醇甲醚)，又名“咳寧醇”，該化合物具有類似于胰島素的作用，用于治療由胰島素耐藥性引起的相關疾病［9］。D-松醇還能夠增強肌肉組織的功能，增加肌肉中糖元的形成，刺激肌肉組織中葡萄糖的運輸，且具有止咳、祛痰作用及典型的抗炎活性和抗急性水腫作用［10-11］。D-松醇還可以促進人體對肌酸的吸收，因此，近年來本品被廣泛應用于醫藥原料和保健品添加劑。

本項目擬采用乙醇溶液提取，通過正交試驗設計，考察提取溫度、乙醇體積分數、提取時間、溶劑用量對土家苗藥夜關門中D-松醇的影響，確定最佳提取工藝條件，為民族藥夜關門的開發提供依據。

1 儀器與試藥

BP211D電子天平 (d=0.01 mg，德國賽多利斯);Waters 515液相色譜儀及Waters 2420蒸發光散射檢測器(美國Waters公司);N3000色譜工作站 (浙江大學);恒溫水浴鍋 (精科華瑞);RE-51旋轉蒸發儀 (上海榮亞生化儀器廠)。

夜關門采集于湖北省恩施州利川市佛寶山森林自然保護區，經朱敏英副教授鑒定為豆科植物夜關門全草;D-松醇對照品 (上海索萊寶生物科技有限公司，批號:10284-63-6);乙腈 (色譜純，美國默克公司);蒸餾水;其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 D-松醇定量測定方法建立

2.1.1 溶液配制

2.1.1.1 供試液的制備 取夜關門全草，粉碎過80目篩，于鼓風干燥箱中干燥至恒重。稱取夜關門粉末10 g，加150 mL 95%乙醇溶液于80℃回流提取3次，每次30 min，合并濾液，減壓濃縮干后用乙醇溶解并定容至100 mL，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液為供試品溶液。

2.1.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取于五氧化二磷干燥器中干燥至恒重的D-松醇對照品20.02 mg，置于5 mL量瓶中，加乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得對照品溶液。

2.1.1.3 陰性對照溶液制備 取溶解對照品的乙醇，過0.45 μm微孔濾膜，即得陰性對照品溶液。

2.1.2 色譜條件［12］Cosmosil Sugar-D色譜柱 (4.6 mm×250 mm);流動相為乙腈-水 (80∶20，V∶V)，體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃;Waters 2420蒸發光散射檢測器檢測，氣壓25 kPa;載氣N2，漂移管溫度設定為55℃;噴霧器級別為60%;增益值100。在上述色譜條件下進樣10 μL，結果見圖1。結果表明，D-松醇峰形良好，與雜質能較好的實現分離 (分離度＞1.5)，陰性無干擾。

圖1 夜關門液相色譜圖

2.1.3 標準曲線及線性關系 精密吸取2.002 mg/mL的對照品溶液，分別加乙醇溶解定容至 0.04、0.1001、0.2002、0.4004、1.001、2.002 mg/mL。按 “2.1.2”項下色譜條件進樣，每個質量濃度進樣3次，以質量濃度C為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，進行回歸分析，得線性方程為Y=32624.7682C+1163.4425，r=0.9998，表明D-松醇在0.04～2.002 mg/mL范圍內，線性關系良好。

2.2 提取工藝研究

2.2.1 單因素實驗 以D-松醇量為指標，考察提取溫度、乙醇體積分數、提取時間、溶劑用量對提取工藝的影響。

2.2.1.1 提取溫度 精密稱取3 g夜關門粉末5份，加水30 mL，分別于40、60、70、80、100℃下浸提3次，每次1 h后過濾，將濾液轉入到100 mL的量瓶中加乙醇稀釋至刻度，微孔濾膜濾過，測定D-松醇，結果顯示，60、70、80和100℃時量均較高，故選用70、80、100℃作為正交試驗水平。

2.2.1.2 乙醇體積分數 精密稱取3 g夜關門粉末5份，分別加入0%、25%、50%、75%、95%的乙醇溶液30 mL，60℃下浸提3次，每次1 h后過濾，將濾液轉入到100 mL的量瓶中加乙醇稀釋至刻度，微孔濾膜濾過，測定D-松醇量。結果顯示，D-松醇量隨著提取溶劑中乙醇體積分數的增大而增大，故選用50%、75%、95%作為正交試驗水平;

2.2.1.3 提取時間 精密稱取3 g夜關門粉末5份，分別加入30 mL水，60℃下浸提3次，每次30、60、90、120、150 min后過濾，將濾液轉入到100 mL的量瓶中加乙醇稀釋至刻度，微孔濾膜濾過，測定D-松醇。結果顯示，D-松醇隨著提取時間的變化不明顯，從成本考慮，故選用30、60、90 min作為正交試驗水平;

2.2.1.4 溶劑用量 精密稱取3 g夜關門粉末5份，分別按料液比1∶2、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20加入50%乙醇溶液，60℃下浸提3次，每次1 h后過濾，將濾液轉入到100 mL的量瓶中加乙醇稀釋至刻度，微孔濾膜濾過，測定D-松醇。結果顯示，D-松醇量隨著提取溶劑用量的增大而增大，提取越完全。綜合成本考慮，故選用料液比1∶5、1∶10、1∶15作為正交試驗水平。

2.2.2 正交試驗優選提取工藝 在單因素實驗的基礎上，以D-松醇量為指標，考察提取時間 (A)、溶劑用量 (B)、提取溫度(C)、乙醇體積分數 (D)對提取工藝的影響。提取方法為精密稱取夜關門粉末10 g，按照L9(34)正交試驗設計，藥液減壓濃縮至干，加乙醇定容至100 mL，測定其中D-松醇。正交試驗因素水平表見表1，結果和方差分析見表2、表3。

表1 正交試驗因素水平

表2 正交試驗結果

表3 方差分析

2.2.3 正交試驗結果分析 由表2和表3可以看出，極差大小顯示各因素主次順序為D＞B＞C＞A，最佳提取條件為A1B3C2D3，以A因素為誤差項的方差分析結果表明，提取溶劑中乙醇的體積分數和提取溶劑的用量對夜關門中D-松醇的提取效果有顯著意義 (P＜0.05)，提取溫度和提取時間對夜關門中D-松醇的提取效果無顯著性意義 (P＞0.05)。考慮各因素影響主次，結合效能和生產成本，最終確定最佳工藝條件為A1B3C2D3，即加15倍量95%乙醇，80℃下回流提取3次，每次30 min。

2.3 優選工藝驗證試驗 精密稱取約10 g干燥至恒重的夜關門粉末5份，加150 mL 95%乙醇，回流提取3次，每次30 min。合并提取液，減壓濃縮干，以95%乙醇溶解并定容至100 mL量瓶中，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，按“2.1.2”項下色譜條件進樣，每個樣品進樣3針，以平均峰面積計算D-松醇。結果見表4。

表4 驗證試驗結果

結果表明，該提取工藝與正交試驗結果基本一致，該工藝合理可行，穩定性較好。

3 討論及結論

3.1 預實驗考察了藥材粉碎粒度對提取工藝的影響，實驗結果是粒度小于80目內對D-松醇提取率的影響不大，呈現持平的趨勢。

3.2 實驗從是否采用浸泡以及浸泡時間的長短對提取率進行比較，取5份夜關門樣品，1份不采取浸泡直接提取，另4份置于室溫下加15倍量水浸泡，浸泡時間分別為0.5 h、1 h、2 h、4 h后進行提取，后進行測定。得知提取到的D-松醇量比不浸泡的相差不大，故本實驗選取最佳提取工藝采用不浸泡。

3.3 基于D-松醇具有重要的應用價值，以及目前的提取工藝所存在的弊端，本實驗以D-松醇為指標，通過L9(34)正交試驗，確定了夜關門中D-松醇的最佳乙醇回流提取工藝，即加15倍量95%乙醇，80℃下回流提取3次，每次30 min。結果顯示，此提取工藝穩定、可重復性高，流程簡單，操作性強，監測手段也常用，能夠用來進行研究D-松醇提取工藝，優化D-松醇的質量控制。這一關鍵技術性提取工藝，為今后充分利用夜關門資源以及進一步開發夜關門制品提供了理論依據，具有重要的現實意義。

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