離子液體微波輔助萃取穿心蓮中內酯類化合物△

陳嘉曦，李尚德

(廣東醫學院 藥學院，廣東 東莞 523808)

廣東醫學院項目(M2012014)

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陳嘉曦，實驗師，研究方向：藥物化學和生物化學；E-mail：cppcc@qq.com

離子液體微波輔助萃取穿心蓮中內酯類化合物△

陳嘉曦*，李尚德

(廣東醫學院 藥學院，廣東 東莞 523808)

目的以離子液體為萃取劑，采用微波輔助萃取法(MAE)對穿心蓮中的穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的萃取進行研究。方法考察了溫度、時間、相比和原藥粒徑等因素對萃取效果的影響，比較了MAE和傳統溶劑回流萃取法(HRE)的萃取率。結果以離子液體([Bmim]Tf2N)為萃取劑，液固比(mL∶g)10∶1，80 ℃微波輔助萃取3 min，穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的萃取率分別為16.08 mg·g-1和4.76 mg·g-1。結論與傳統的萃取方法比較，本方法快速高效、對環境無污染。

穿心蓮；微波輔助萃取；離子液體；穿心蓮內酯；脫水穿心蓮內酯

穿心蓮Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees為爵床科穿心蓮屬植物，別名一見喜、斬蛇草、苦草、橄欖蓮，原產于印度，現廣泛分布于我國福建、廣東、廣西、海南、云南等地。穿心蓮為常用中藥，具有清熱解毒，涼血，消腫功能。用于感冒發熱，咽喉腫痛，口舌生瘡，頓咳勞嗽，泄瀉痢疾，熱淋澀痛，癰腫瘡瘍，蛇蟲咬傷[1]。

微波輔助萃取技術，具有設備簡單、適用范圍寬、萃取效率高、重現性好、節省時間、節省試劑等特點，被廣泛應用于天然產物萃取[2]。在微波輔助萃取中草藥中有效活性成分時，萃取溶劑需要有一定的極性才能吸收微波進行內部加熱，通常選用極性較強的溶劑或者是極性溶劑和非極性溶劑的混合液，如甲醇、乙醇、二氯甲烷-甲醇、水-甲苯等，但這些揮發性有機溶劑在樣品前處理過程中會引起環境污染。最近幾年離子液體、表面活性劑等各種新型的綠色溶劑開始用于微波輔助萃取，并取得了良好的萃取效果[3]。離子液體是由有機陽離子和無機(有機)陰離子構成的在室溫或接近室溫下(通常低于100 ℃)呈液體狀態的鹽類[4-6]，非常適合做MAE萃取溶劑，因為離子液體是由離子組成的，具有蒸氣壓低、揮發性小、溶解能力強、萃取能力好、液態范圍寬等獨特的物理化學性質，同時對微波具有強的吸收和熱轉換能力[7]。將離子液體作為萃取劑、微波吸收劑，采用微波輔助萃取，較好地發揮了離子液體與微波技術的優勢，為天然產物綠色、高效萃取提供了新方法。

本實驗以穿心蓮藥材中穿心蓮內酯(andrographolide)、脫水穿心蓮內酯(dehydroandrographolide)這兩種內酯類化合物為目標，以微波為輔助萃取手段、離子液體1-丁基-3-甲基咪唑雙三氟甲基磺酰亞胺鎓鹽([Bmim]Tf2N)為萃取劑及微波吸收劑，對影響萃取的主要因素，如萃取溫度、萃取時間、原藥粒徑、相比(固/液)等工藝參數進行了系統研究，并以反相HPLC為表征手段，對兩種穿心蓮內酯類化合物進行了定量分析，為中藥中活性成分的萃取開拓了新思路。

1 材料與儀器

1.1 試藥

穿心蓮樣品(湛江穿心蓮規范化種植基地，莖與葉混合)；穿心蓮內酯對照品(批號：0797-200206)、脫水穿心蓮內酯對照品(批號：0854-200204)，購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。離子液體([Bmim]Tf2N)根據文獻所述方法制備[8]。產物用1H-NMR 和13C-NMR檢測離子液體的純度，NMR譜圖表明離子液體中沒有其他有機雜質。

1.2 實驗裝置與分析儀器

MDS-10高通量微波消解萃取合成工作站(上海新儀微波化學科技有限公司)；Agilent1100系列高效液相色譜儀，Agilent自動進樣器，Agilent DAD檢測器；Agilent extend C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

2 方法

2.1 微波輔助萃取(MAE)

將穿心蓮自然晾干、粉碎成粉、過篩，得到<0.096，0.096～0.15，0.15～0.18和0.18～0.25 mm 4種不同粒徑樣品。準確稱取0.5 g穿心蓮樣品于放有轉子的反應管中，加入5 mL[Bmim]Tf2N，用磁力攪拌器攪拌，使穿心蓮粉末盡量均勻分散在[Bmim]Tf2N相中。萃取實驗結束后，用甲醇定容50 mL，待測。

2.2 溶劑回流萃取(SRE)

精密稱取穿心蓮藥材干燥粉末(60 ℃干燥)1.0 g，加甲醇100 mL，索氏提取至餾出液為無色(約3.5 h)，萃取液用旋轉蒸發儀蒸出大部分溶劑，再用甲醇將其定容為100 mL。

2.3 對照品溶液的配制

精密稱取穿心蓮內酯對照品和脫水穿心蓮內酯對照品適量，加甲醇溶解，搖勻，制成每l mL含穿心蓮內酯0.1 mg和脫水穿心蓮內酯0.1 mg的對照品溶液。

2.4 HPLC定量方法

分別準確吸取穿心蓮內酯與脫水穿心蓮內酯對照品溶液、樣品溶液5 μL，以0.45 μm微孔濾膜過濾，注入HPLC色譜儀，進行分析，測定時間為1 h，流動相為以甲醇-水(30∶70)0～60 min(60∶40)梯度洗脫，流速：1.0 mL·min-1，檢測波長：226 nm，柱溫：25 ℃。結果見色譜圖1、2。色譜圖中，在RT9.584、15.016、21.218、24.204、26.549、38.312、44.444和46.112處分別有明顯的色譜峰，這8個色譜峰為穿心蓮有效成分的主要特征色譜峰和共有色譜峰。

圖1 穿心蓮內酯與脫水穿心蓮內酯對照品HPLC圖

圖2 穿心蓮藥材HPLC圖

2.5 微波輔助離子液體萃取法的標準曲線制備

精密稱取穿心蓮內酯8.55 mg、脫水穿心蓮內酯對照品20.75 mg，置于50 mL 量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每l mL 中含穿心蓮內酯171.0 μg和脫水穿心蓮內酯415.0 μg的對照品溶液，備用。分別精密吸取上述對照品溶液1，2，4，6，8，10 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，進樣測定。以對照品進樣濃度為橫坐標(X)，峰面積積分值為縱坐標(Y)繪制標準曲線，得穿心蓮內酯回歸方程為Y=3.844×10-5X+2.575，r=0.999 9；脫水穿心蓮內酯回歸方程為Y=5.840×10-5X+4.453，r=0.999 9。結果表明穿心蓮內酯進樣濃度在17.1～171 μg·mL-1與穿心蓮內酯峰面積呈良好的線形關系。脫水穿心蓮內酯進樣濃度在41.5～415μg·mL-1與穿心蓮內酯峰面積呈良好的線形關系。

2.6 加樣回收率試驗

準確稱取穿心蓮樣品0.5 g，分別精密加入混合對照品溶液(穿心蓮內酯6.50 mg·mL-1、脫水穿心蓮內酯2.00 mg·mL-1)1 mL，按照建立的微波輔助萃取方法提取，每個實驗重復5次，計算回收率。結果見表1。

表1 穿心蓮中兩種內酯的回收率試驗

注：穿心蓮內酯對照品加入量為6.500 mg，脫水穿心蓮內酯對照品加入量為2.000 mg

3 結果

3.1 萃取影響因素

3.1.1 溫度對萃取的影響 如圖3所示，穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯的萃取效率均隨溫度升高而提高，其中，穿心蓮內酯的萃取效率在80 ℃時達最高，脫水穿心蓮內酯在系統溫度為90 ℃時萃取率最高。因樣品中穿心蓮內酯含量遠高于脫水穿心蓮內酯，綜合考慮，選擇實驗萃取溫度為80 ℃。

3.1.2 時間對萃取的影響 如圖4所示，萃取在2 min時幾乎達到平衡，隨時間延長，萃取效率幾乎沒有變化，因此實驗反應時間為3 min已經能萃取完全。這也證明了微波輔助萃取法不僅能節約時間，同時在能量利用上也實現了節約、高效。

圖3 萃取溫度對萃取的影響

圖4 萃取時間對萃取的影響

3.1.3 粒徑對萃取的影響 對4種粒徑(<0.096，0.096～0.15，0.15～0.18、0.18～0.25 mm)穿心蓮樣品中穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯的萃取進行了考察，發現粒徑對萃取影響較小，萃取效率差別不大。

3.1.4 相比對萃取的影響 離子液體對穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯的萃取效率在固體/液體比為1∶30～1∶10(g∶mL-1)沒有顯著變化。可見，在工藝條件允許范圍內，相比對萃取影響較小，離子液體單次萃取并未達到飽和。基于以上數據，最終選擇1∶10(g∶mL)為最終提取的固液比條件。

3.2 微波輔助離子液體萃取與傳統萃取方法比較

如表2所示，微波輔助離子液體萃取法(MAE)對穿心蓮內酯類化合物的萃取效率顯著比甲醇回流萃取法(HRE)高，對穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的提取率分別提高38%和33%。

對比MAE和HRE，在萃取穿心蓮樣品時，MAE具有較特別的熱力學和動力學機理[9-10]，在相同萃取條件下具有顯著的優勢。從表2可知，采用MAE技術，利用離子液體([Bmim]Tf2N)為萃取劑，不僅穿心蓮內酯類化合物的萃取率高，回收率好，并可避免揮發性有機溶劑的使用，另外微波萃取法用時短，所需溶劑量小。以固液比(g∶mL)10∶1、80 ℃微波輔助萃取3 min，穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的萃取率分別為16.08 mg·g-1和4.76 mg·g-1。

表2 穿心蓮微波輔助離子液體萃取與傳統萃取方法比較

4 討論

目前穿心蓮藥材及其制劑的質量控制和評價多以穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯含量為指標。《中國藥典》2010版規定穿心蓮藥材質量控制方法為測定穿心蓮內酯與脫水穿心蓮內酯的含量，兩者的總量不得少于0.8%，本實驗穿心蓮藥材的穿心蓮內酯類化合物超過2.1%。上述研究結果表明，溫度是影響萃取的最主要因素。溫度較低時進行微波輔助萃取，微波破壞細胞壁使有效成分得到釋放，在達到最大萃取效率前，萃取效率呈上升趨勢；達到某一溫度后，細胞結構完全被破壞；而當萃取溫度超過該臨界溫度后，過高的溫度又會破壞或改變穿心蓮中某些成分的分子結構，使表觀上萃取效率有所下降[11]。因此，可推斷微波輔助離子液體萃取效率的提高是微波破壞作用與熱效應的協同作用，并且以離子液體為溶劑，采用微波輔助萃取的機理與傳統有機溶劑的萃取機理基本一致[12]，采用該方法萃取穿心蓮中的穿心蓮內酯類化合物，快速、高效，對環境無污染。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：251-252.

[2] 李攻科，杜甫佑，肖小華.微波輔助萃取技術在中藥現代化中的應用[J].精細化工，2007，24(12)：1184-1191.

[3] 盧彥芳，張福成，安靜，等.微波輔助萃取應用研究進展[J].分析科學學報，2011，27(2)：246-252.

[4] Rogers R D，Seddon K R.Ionic Liquids—Solvents of the Future [J].Science，2003，5646：792-793.

[5] Huddleston J G，Willauer H D，Rogers R D，et al.Room Temperature Ionic Liquids as Novel Media for ‘Clean’ Liquid?Liquid Extraction [J].Chem Commun，1998，16：1765-1766.

[6] 張鎖江，呂興梅，寇元.離子液體-從基礎研究到工業應用[M].北京：科學出版社，2006：183-192.

[7] Hoffmann J，Nuchter M，Ondruschka B，et al.Ionic liquids and their heating behaviour during microwave irradiation-a state of the art report and challenge to assessment[J].Green Chem，2003，5：296-299.

[8] Huddleston J G，Visser A E，Reichert M R.Characterization and Comparison of Hydrophilic and Hydrophobic Room Temperature Ionic Liquids Incorporating the Imidazolium Cation[J].Green Chem，2001，3(4)：156-164.

[9] 范華均，林廣欣，肖小華，等.微波輔助提取石蒜和虎杖中有效成分的動力學機理[J].分析化學，2006，34(9)：1260-1264.

[10] 范華均，林廣欣，肖小華，等.微波輔助提取石蒜和虎杖中有效成分的熱力學機理研究[ J].高等學校化學學報，2006，27(12)：2271-2276.

[11] 張之達，陳吉平，李長平，等.離子液體微波輔助萃取川芎中內酯類化合物[J].過程工程學報，2010，10(3)：498-502.

[12] 韋藤幼，趙鐘興，梁必瓊.微波預處理提取銀杏葉黃酮的工藝研究和機理探討[J].中成藥，2005，7(6)：637-640.

Microwave-assistedExtractionofLactonefromAndrographisPaniculataUsingIonicLiquidMAEMethod

CHENJiaxi*，LIShangde

(SchoolofPharmacy，GuangdongMedicalCollege，Dongguan，523808，China)

A microwave-assisted extraction(MAE)method was used to extract andrographolide and dehydroandrographolide fromAndrographispaniculata(Burm.f.)Nees.Ionic liquid was employed as extractant.Influential factors such as system temperature，extraction time，phase ratio and particle size were examined.The yield of the two target ingredients was compared between MAE and solvent reflux extraction(HRE).The optimal MAE conditions were：the solvent was [Bmim] Tf2N solution，the ratio of liquid/solid(mL∶g)was 10∶1，the extraction temperature was 80 ℃，and time was 3 min.Under this condition，the yields of andrographolide and dehydroandrographolide were 16.08 mg·g-1and 4.76 mg·g-1respectively.

Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees；Microwave-assisted extraction；Ionic liquids；Andrographolide；Dehydroandrographolide

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.05.015

2013-12-24)