不同產(chǎn)地及不同藥用部位大葉蛇葡萄中蛇葡萄素和楊梅苷的含量測定△

陳敏，凃媛，桂春，程佩佩，嚴(yán)瀛灝，張秀橋

(湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430065)

國家自然科學(xué)基金項目(31170335)；武漢市重點科技攻關(guān)計劃項目(201160823265)

*

張秀橋，教授，研究方向：中藥的品種、質(zhì)量及資源開發(fā)研究；Email：qiaoxzh2000@163.com

不同產(chǎn)地及不同藥用部位大葉蛇葡萄中蛇葡萄素和楊梅苷的含量測定△

陳敏，凃媛，桂春，程佩佩，嚴(yán)瀛灝，張秀橋*

(湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430065)

目的建立RP-HPLC同時測定不同產(chǎn)地、不同藥用部位大葉蛇葡萄中蛇葡萄素和楊梅苷含量的方法。方法大葉蛇葡萄樣品先用石油醚超聲脫脂，再用甲醇超聲提??；分析柱選用Angilent TC-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸水溶液進(jìn)行洗脫(20∶80，v/v)，柱溫25 ℃，流速1.0 mL·min-1，檢測波長254 nm。結(jié)果蛇葡萄素在16.6～415.0 μg·mL-1與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(r=0.999 8)，平均回收率為98.25%，RSD=1.14%(n=6)；楊梅苷在1.0～25.5 μg·mL-1與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(r=0.999 5)，平均回收率為98.19%，RSD=1.16%(n=6)。結(jié)論蛇葡萄素和楊梅苷成分因產(chǎn)地和藥用部位不同，含量差異較大。該方法操作簡便、可靠，可為大葉蛇葡萄的質(zhì)量控制和開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

大葉蛇葡萄；蛇葡萄素；楊梅苷；RP-HPLC

大葉蛇葡萄AmpelopsismegalophyllaDiels et.Gilg為葡萄科蛇葡萄屬植物，曾以“霉茶”之名收載于《湖北中草藥志》，為湖北西部地區(qū)常用中草藥，藥用其葉和嫩莖。性涼，味微澀，具有清熱涼血等功效，用于高血壓、頭昏目脹等治療[1]。本課題組前期對大葉蛇葡萄進(jìn)行了藥材性狀、顯微鑒別研究[2]以及化學(xué)成分研究[3]，從中分離和鑒定了蛇葡萄素、楊梅素及楊梅苷等9個成分；并對其提取物進(jìn)行了藥理活性篩選，確定乙酸乙酯部位為降血壓有效部位[4]，且進(jìn)一步確定了蛇葡萄素、楊梅苷等為降血壓活性成分[5]。本文采用RP-HPLC對湖北鄂西自治州來鳳縣不同產(chǎn)地大葉蛇葡萄樣品及同一樣品不同藥用部位中活性成分蛇葡萄素和楊梅苷的含量進(jìn)行測定及比較分析，為大葉蛇葡萄的質(zhì)量控制和開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料

Dionex-P680高效液相色譜儀(四元泵系統(tǒng)、Dionex-UVD170U紫外檢測器、色譜柱恒溫箱、Dionex-chemistation色譜工作站，德國)；分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；KB-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

乙腈(色譜純，天地公司)，雙蒸水，甲醇、石油醚(60～90 ℃)及磷酸均為分析純。蛇葡萄素對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：20120916，供含量測定用)，楊梅苷對照品(上海同田生物技術(shù)有限公司，批號：11060222，供含量測定用)。大葉蛇葡萄藥材共11批，見表1，分別采集于湖北省鄂西自治州來鳳縣，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張秀橋教授鑒定為AmpelopsismegalophyllaDiels et.Gilg 的莖葉、花、果實。

表1 大葉蛇葡萄藥材來源

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

大葉蛇葡萄樣品于60 ℃干燥至恒重，用粉碎機(jī)粉碎，過60目篩。精密稱取樣品約0.5 g，置錐形瓶中，加入石油醚25 mL，浸泡30 min，超聲(功率250 W,頻率40 kHz)提取30 min，過濾，揮干溶劑；濾渣加甲醇25 mL，稱重，浸泡30 min，超聲(功率250 W,頻率40 kHz)提取30 min后放冷，稱重，用甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，振蕩搖勻，過濾；精密吸取續(xù)濾液1 mL于25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，振蕩搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取減壓干燥至恒重的蛇葡萄素和楊梅苷對照品適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含蛇葡萄素830.0 μg、楊梅苷51.0 μg的溶液，作為混合對照品溶液。

2.3 色譜條件

Angilent TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液(20∶80，v/v)，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為25 ℃，檢測波長為254 nm，進(jìn)樣量為20 μL。混合對照品及樣品色譜圖見圖1。

A.混合對照品 B.樣品 1.蛇葡萄素 2.楊梅苷圖1 混合對照品及大葉蛇葡萄樣品HPLC圖

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取上述混合對照品溶液0.2，2，3，4，5 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別按2.3項下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。以質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。蛇葡萄素回歸方程：Y=132.27X+0.192 6(r=0.999 8)；楊梅苷回歸方程：Y=0.318 5X+0.115 9(r=0.999 5)。結(jié)果表明蛇葡萄素和楊梅苷分別在16.6～415.0 μg·mL-1、1.0～25.5 μg·mL-1呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

精密吸取蛇葡萄素和楊梅苷混合對照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，蛇葡萄素和楊梅苷峰面積RSD分別為1.48%，1.44%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取S9號樣品1份，按2.1項下的方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h進(jìn)行測定，蛇葡萄素和楊梅苷峰面積的RSD分別為1.76%、1.78%。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗

取S9號樣品6份，分別按2.1項下方法制備供試品溶液，按2.3項下色譜條件測定蛇葡萄素和楊梅苷峰面積，以外標(biāo)法計算含量，蛇葡萄素和楊梅苷含量的RSD分別為2.59%、2.78%。結(jié)果表明供試品溶液制備方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知蛇葡萄素和楊梅苷含量的S9號樣品6份，每份約0.25 g，分別精密加入蛇葡萄素對照品和楊梅苷對照品適量，按2.1項下方法制備供試品溶液，按2.3項下色譜條件測定蛇葡萄素和楊梅苷峰面積，計算含量和回收率，結(jié)果見表2和表3。

表2 大葉蛇葡萄中蛇葡萄素回收率試驗

表3 大葉蛇葡萄中楊梅苷回收率試驗

2.9 樣品含量測定

精密稱取不同來源及不同藥用部位的樣品粉末各0.5 g，按2.1項下方法制備供試品溶液，按2.3項下色譜條件測定蛇葡萄素和楊梅苷峰面積，以外標(biāo)法計算含量，結(jié)果見表4。

表4 不同來源及不同藥用部位大葉蛇葡萄中蛇葡萄素和楊梅苷含量測定 /%

注：—表示未檢出

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

楊梅苷在254 nm處有最大吸收，蛇葡萄素在292 nm處有最大吸收，在254 nm處有吸收，故選擇檢測波長為254 nm。

3.2 流動相的選擇

本文考察了乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液和乙腈-0.4%磷酸水溶液，其中0.1%和0.4%的流動相系統(tǒng)得到的峰型較好，但0.4%磷酸水溶液酸度較高，對色譜柱損壞較大，故選擇乙腈-0.1%磷酸水為流動相。同時比較了等度洗脫和梯度洗脫，結(jié)果顯示等度洗脫分離效果已較好，故選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液(20∶80，v/v)等度洗脫30 min。

3.3 柱溫的選擇

在等度洗脫條件下，分別比較了25，30，40 ℃柱溫條件下的分離效果，結(jié)果顯示25 ℃分離效果良好，故選擇柱溫25 ℃。

3.4 供試品溶液制備方法的選擇

考察了不加石油醚脫脂、石油醚超聲脫脂和石油醚回流脫脂3種方法制備供試品溶液，結(jié)果顯示不加石油醚脫脂，色素易對色譜柱造成死吸附，且常出現(xiàn)肩峰；石油醚超聲脫脂和石油醚回流脫脂后的峰型相似，由于石油醚回流脫脂需回流2 h，耗時較長，故選擇石油醚超聲脫脂。

3.5 不同產(chǎn)地樣品中蛇葡萄素和楊梅苷的含量分析

該兩種成分因產(chǎn)地不同，含量差異較大，其中來鳳縣革勒鄉(xiāng)小河村2組3(S9)蛇葡萄素含量最高，來鳳縣革勒鄉(xiāng)土家寨村2(S3)楊梅苷含量最高。

3.6 不同藥用部位中蛇葡萄素和楊梅苷的含量分析

大葉蛇葡萄不同藥用部位的蛇葡萄素和楊梅苷含量差異較大。比較S3號樣品葉和嫩莖、莖、果實、花4個部位中蛇葡萄素和楊梅苷的含量，結(jié)果蛇葡萄素的含量為：花>葉和嫩莖>莖>果實，楊梅苷的含量為：葉和嫩莖>花>莖>果實，果實中蛇葡萄素和楊梅苷的含量幾乎不能檢出。實驗結(jié)果提示傳統(tǒng)習(xí)用其葉和嫩莖的準(zhǔn)確性，同時提示其花具有藥用價值。

[1] 湖北省衛(wèi)生局.湖北中草藥志[M].第二冊.武漢：湖北人民出版社,1982：1090-1091.

[2] 張秀橋,程蓮銀,張琦，等.霉茶的性狀和顯微特征[J].中藥材,2004,27(5)：330-332.

[3] 張秀橋,沈偉,陳樹和，等.大葉蛇葡萄化學(xué)成分的研究[J].中草藥,2008,39(8)：1135-1137.

[4] 孫曉杰,沈偉,張秀橋，等.大葉蛇葡萄抗高血壓有效部位篩選實驗研究[J].齊魯藥事,2008,27(12)：747-749.

[5] 張秀橋,沈偉,陳樹和，等.大葉蛇葡萄提取物對腎性高血壓大鼠降壓作用的實驗研究[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2008,28(24)：2095-2096.

DeterminationofAmpelopsinandMyricitrininAmpelopsismegalophyllafromDifferentPlacesandMedicinalPartsbyRP-HPLC

CHENMin，TUYuan，GUIChun，CHENGPeipei，YANYinghao，ZHANGXiuqiao*

(HubeiUniversityofChineseMedicine，Wuhan430065，China)

Objective：Establish RP-HPLC method for determining of Ampelopsin and Myricitrin inAmpelopsismegalophyllafrom different places and medicinal parts.MethodsAfter ultrasonic treatment with petroleum ether and methanol,the separation was achieved on a Angilent TC-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)column at 25 ℃ using methyl cyanide-0.1% phosphoric acid solution( 20∶80,v/v)as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was 254 nm.ResultsAmpelopsin showed good linear at the range of 16.6～415.0 μg·mL-1(r=0.999 8).The recovery was 98.25% and RSD was 1.14%(n=6).Myricitrin showed good linear at the range of 1.0～25.5 μg·mL-1(r=0.999 5).The recovery was 98.19% and RSD was 1.16%(n=6).ConclusionThe contents of the two components are obviously different because from different places and medicinal parts.The proposed method is simple and reliable.It can provide experimental evidence for quality control，development and utilization ofAmpelopsismegalophylla.

Ampelopsismegalophylla；Ampelopsin；Myricitrin；RP-HPLC

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.04.006

2013-10-13)