甲胎蛋白陰性肝癌射頻消融治療前血清中轉移相關miRNA的臨床價值

占美曉， 李 勇， 胡寶山， 何 旭， 黃建文， 陸驪工

近年來，以射頻消融術（RFA）為主的微創治療在早期肝癌治療中的療效越來越得到認可。然而研究發現RFA術后的5年復發率卻可高達70%，術后高復發率已成為影響患者RFA術后遠期療效的重要因素［1-2］。 對于血清甲胎蛋白（AFP）升高的肝癌患者，AFP常作為腫瘤標記物以預測腫瘤復發或預后。臨床上仍然有30%～40%患者AFP陰性（≤20 ng/ml），對此類患者，目前尚無理想的腫瘤標記物［3］。 microRNA（miRNA）是一類進化上高度保守的非編碼單鏈RNA，可影響細胞發育、分化、干細胞功能等多種病理生理過程，在腫瘤發生和轉移過程中亦發揮重要作用。近年，諸多研究已經證實腫瘤組織中高表達的miRNAs可以釋放到循環血液中，且表達穩定，循環miRNAs（血清或血漿等）被廣泛用于理想的腫瘤標記物［4-5］。本研究選擇的轉移相關miR-18b在肝癌組織中高表達且與腫瘤復發預后密切相關［6］，本研究重點探索miR-18b是否可以作為腫瘤標記物去監測AFP陰性肝癌患者RFA術后復發。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

2007年1月—2011年1月，我科診治的接受RFA治療的AFP陰性肝癌患者131例，收集患者RFA治療前1～2 d的血清標本。肝癌診斷標準根據衛生部制定的原發性肝癌診療規范（2011年版），所有患者均行肝穿刺活檢病理確診為肝細胞癌。RFA治療儀器采用RITA射頻治療系統（美國）。納入的患者中男98例，女33例，平均年齡57.6歲；87例患者單病灶，44例患者多病灶 （2個或3個）；腫瘤平均直徑3.2 cm。我們選取43例健康體檢者的血清標本作為對照組，包括男31例，女12例。本研究獲得醫院倫理委員會的批準且所有納入的研究者均獲得知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標本的采集 本組患者在RFA術前1～2 d采集靜脈血標本約8 ml，室溫下靜置30 min，靜置后于4℃1 500 r/min離心10 min。將上層血清吸出移至新的1.5 ml EP管，放置于-80℃冰箱保存備用。

1.2.2 血清miR-18b的檢測 所有血清樣本放置于冰上，每個樣本取300 μl轉移至含有750 μl TRI Reagent BD的新EP管中，依據TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國）說明書抽提總 RNA，所有RNA通過分光光度計檢測并定量，提取好的RNA保存于-80℃冰箱內。采用實時定量PCR技術檢測miR-18b 表達量［7］， 反轉錄總反應體系為 18 μl，PCR總反應體系為 19 μl。選擇 U6作為內參基因，miR-18b的相對表達量用 2-ΔΔCT表示， 其中ΔCT肝癌患者/健康正常人= CTmiRNAs- CTU6；ΔΔCT =ΔCT肝癌患者- ΔCT健康正常人。

1.2.3 隨訪 隨訪截止時間為2012年5月。所有患者術后1個月行腹部增強CT觀察消融效果，RFA術后未能達到腫瘤完全消融的患者被排除于本研究。其后每3個月行腹部增強CT檢查及血清檢測AFP及肝功能指標以判斷有無出現復發或轉移。RFA術后復發形式主要有腫瘤局部進展、肝內遠處復發及肝外轉移。

1.3 統計學分析

計量資料以均數±標準差表示，兩組血清miR-18b的表達差異及其同臨床病理資料間的關系用t檢驗或秩和檢驗。Kaplan-Meier生存分析和log-rank檢驗分析miR-18b表達量同患者總生存率及無復發生存率的關系。數據分析采用SPSS13.0統計軟件，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-18b在肝癌患者中表達差異及相關的臨床病理因素

miR-18b在AFP陰性肝癌患者血清中表達水平顯著高于健康正常人（2.93±1.33對1.08±0.45，P＜0.01，圖1）。超過85%患者miR-18b表達上調的倍數在2倍以上。所有131例患者中，血清miR-18b表達水平上調的中位倍數為2.7倍。以3倍為分界點，我們將131例肝癌患者分為高表達組（66例）和低表達組（65例）。研究結果顯示：miR-18b表達水平差異與肝硬化、腫瘤直徑及腫瘤分化程度密切相關，而與性別、乙肝表面抗原、腫瘤數目等無明顯相關性（表1）。

2.2 血清miR-18b與肝癌患者RFA術后復發之間的關系

截止至末次隨訪日，共有79例患者（60.3%）出現復發。肝內復發70例，包括13例肝內腫瘤局部進展和57例肝內遠處復發。16例出現肝外轉移，其中7例合并肝內遠處和肝外轉移。結果顯示出現復發患者血清miR-18b的表達水平顯著高于無復發患者（3.26± 1.28比 2.42±0.86，P ＜0.01，圖 1）。根據復發的不同形式，進一步分析兩組血清miR-18b表達水平與復發率之間的關系顯示：miR-18b高表達組患者RFA術后肝內遠處復發率 （P=0.018）和肝外轉移發生率（P=0.102）均高于低表達組（表2），而兩組在腫瘤局部進展發生率上無差異 （P=0.792）。

圖1 肝癌患者及健康正常人血清中miR-18b的表達水平

2.3 血清miR-18b與總生存率及無復發生存率的關系

表1 血清miR-18b表達高低同肝癌患者臨床病理因素間的關系

表2 血清miR-18b同RFA術后不同復發形式發生率之間的關系 n（%）

肝癌患者 1、3、5年總生存率分別為 86.3%、63.4% 、43.5% ；1、3、5 年 無 復 發 生 存 率 分 別 為64.9%、41.7%、29.0%。Kaplan-Meier生存分析顯示miR-18b高表達組患者總生存率和無復發生存率均顯著低于低表達組患者，差異均具有統計學意義（見圖 2）。

3 討論

圖2 miR-18b高低表達與RFA術后有無復發的比較

Kao 等［8］報道對于 AFP 升高的患者，RFA 術前術后AFP的變化可以預測肝癌患者的復發及總生存率。對于AFP陰性肝癌患者，有報道顯示血管內皮生長因子（VEGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）等腫瘤標記物可以用來預測外科切除或肝動脈化療栓塞（TACE）術后腫瘤復發或轉移［9-10］。 本研究重點探索可以用于預測AFP陰性患者RFA術后腫瘤進展、預后的標記物，對判斷RFA術后患者的遠期療效意義重大。

血清miRNAs為腫瘤標記物的探索提供了新的視角。相比腫瘤組織取材，血清取樣具有創傷小、操作簡便、可重復性等優點。本研究結果顯示肝癌患者血清中miR-18b的普遍高表達，且與肝硬化、腫瘤直徑及腫瘤分化程度相關。此研究結果與前期Murakami等［6］在腫瘤組織中觀察到 miR-18b的表達規律相一致。諸多證據已證實腫瘤組織或細胞內特異的miRNAs在細胞破壞或病理損害的過程中會釋放到循環血液中，而在血清或血漿中穩定表達［11-12］。肝癌RFA治療后腫瘤組織缺血、壞死，部分腫瘤細胞凋亡或停止增殖，因此我們有理由推測血清中高表達的miR-18b可能來自腫瘤組織熱消融過程中組織壞死釋放入血液中，血清miR-18b表達水平差異或可一定程度上反映腫瘤的消融壞死情況。

血清miRNAs除了可以用于腫瘤疾病的診斷外，如前列腺癌［13］、胃癌［5］等，還可以用于腫瘤患者不同方法治療后的療效評估。Zhao等［14］發現血漿miR-221可以預測乳腺癌患者新輔助化療的耐藥性的出現；Jung等［15］研究提示乳腺癌患者血漿miR-210表達水平顯著升高，且和曲妥珠單抗藥物敏感性、淋巴結轉移等密切相關。Murakami等［6］研究提示miR-18b通過調控靶基因TNRC6B的表達，在肝癌細胞轉移、血管侵犯、腫瘤進展等方面扮演重要角色，組織中高表達miR-18b或低表達TNRC6B的患者預后差，無復發生存率顯著降低。本研究通過結合特殊臨床特征的（AFP陰性）肝癌患者RFA術前血清miR-18b的表達水平和RFA術后復發轉移預后的情況進行分析，發現血清中高表達的miR-18b與RFA術后高復發率之間密切相關，且可以作為腫瘤標記物去預測肝癌患者RFA術后無復發生存率。除無復發生存率外，本研究結果也提示血清中miR-18b高表達的患者預后差，總生存率顯著低于表達組患者。

綜上所述，本研究結果提示血清miR-18b具有成為肝癌理想腫瘤標記物的優勢，可用以監測AFP陰性肝癌患者RFA術后復發和預測患者總生存率。miRNAs在腫瘤發生發展中調控的基因網絡復雜，常既充當“癌基因”又可充當“抑癌基因”的角色，因此在本研究的基礎上，以下問題后續仍需繼續探索：肝癌患者血清中其他轉移相關miRNAs（miR-151、miR-222、miR-30 d）的臨床價值的探索；能否聯合其他類型腫瘤標記物 （VEGF、缺氧誘導因子-1a等）去判斷腫瘤進展及預后；擴大樣本量，進一步驗證血清miR-18b的價值以便真正轉化臨床，使患者受益。

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