一測多評法測定黃柏中5種生物堿

吳珊珊，胡昌江，呂非非，高 源，李文兵

(成都中醫藥大學藥學院，四川成都 611137)

黃柏為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinense Schneid.的干燥樹皮，具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效［1］，為臨床常用藥物。其主要成分有小檗堿、黃柏堿、木蘭花堿、巴馬汀、藥根堿等生物堿類，其中含有量最高的為小檗堿［2-4］。現代藥理研究表明，鹽酸小檗堿具有抗炎，降血壓，降血糖和免疫調節等作用，黃柏堿與降壓作用有關，而巴馬汀、藥根堿為抗病原微生物的有效成分［5-6］。2010年版《中國藥典》以小檗堿和黃柏堿的量作為黃柏質量控制指標，尚不能全面反應黃柏的質量。目前，雖有文獻報道，采用HPLC法同時測定黃柏中多種生物堿的量［7-8］，但需要多種對照品，限制了實際工作中的應用。

本實驗以小檗堿為參照物，得出黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、巴馬汀與小檗堿之間的相對校正因子(F)，同時測定了黃柏中木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿的量，建立一測多評法(QAMS)［9-17］，從而降低檢測成本和時間，提高方法的實用性。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相系統，Shimadzu LC-20AT高效液相系統，FE20梅特勒-托利多pH計，Sartorius BP211D電子分析天平，KQ-300E超聲儀(40 kW)，乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

木蘭花堿(Must-12022901)、鹽酸黃柏堿(Must-12021407)、鹽酸藥根堿(Must-10122001)、鹽酸巴馬汀(Must-11122703)和鹽酸小檗堿(Must-111212110)均購自成都曼斯特生物科技有限公司，純度為98%。黃柏樣品1～3號購自廣西，4～7號購自貴陽，8～9號購自湖北，10號購自湖南，11～30號購自四川滎經、青城山、都江堰、彭州、瀘州等地藥材市場和不同的飲片公司。經本校生藥室教研室盧先明教授鑒定為黃皮樹Phellodendron chinense Schneid.的干燥樹皮。

2 分析方法與結果

2.1 一測多評方法學考察

2.1.1 色譜條件 Phenomenex Luna C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，Thermo C18(4.6 mm×250 mm，5μm)，Diamonsil C18(2)(4.6 mm×250 mm，5μm)。柱溫 30 ℃，體積流量1mL/min，檢測波長280 nm，流動相A為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀(KH2PO4)(45∶55)(每100 mL中加入0.4 g十二烷基硫酸鈉，調節pH至4.8)，流動相 B為乙腈-0.05 mol/L KH2PO4(55∶45)(每100 mL中加入0.4 g十二烷基硫酸鈉，調節pH至4.5)，梯度洗脫，0～12 min(0 B)，12～18 min(0～100%B)，18～40 min(100%B)，40～42 min(100% ～0 B)，42～48 min(0 B)。上述色譜條件下，各組分分離度良好，色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品(A)和樣品(B)的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and samples(B)

2.1.2 對照品溶液的制備 取木蘭花堿、鹽酸黃柏堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿5種生物堿，精密稱定 10.24、9.8、9.09、10.92、14.42 mg，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度。再稀釋至適當質量濃度。精密移取稀釋后的5個對照品溶液適量配為混合對照品溶液。將上述溶液保存于4℃冰箱中備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 取黃柏藥材粉末(過4號篩)約0.5 g，精密稱定，置于100 mL錐形瓶，精密加入鹽酸-甲醇(1∶100)的混合液40 mL，稱定質量，超聲30 min，冷卻后加鹽酸-甲醇(1∶100)的混合液補足失質量，過濾，取續濾液過0.45μm 濾膜，5μL 進樣。

2.1.4 線性范圍考察 精密吸取上述混合對照品溶液40、20、10、8、6、4、2、1μL，進樣分析，每個質量濃度進樣3次，取平均值。以進樣量對峰面積積分值進行回歸處理，得小檗堿、木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀的標準曲線見表1。

表1 黃柏中5種生物堿類成分的標準曲線Tab.1 Standard curves of five alkaloids

2.1.5 校正因子計算 以小檗堿為內標，計算小檗堿對木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀的校正因子，見表2。

表2 黃柏生物堿相對校正因子Tab.2 Relative correction factors(RCF)of alkaloids

2.1.6 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液5μL于同一天內連續進樣5次，記錄木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿的峰面積，得出日內精密度分別為 0.68%、0.74%、1.30%、0.93%和0.81%。表明儀器較為穩定。

2.1.7 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液5μL分別于配制后的0、2、4、8、12、24、48 h測定峰面積，計算得木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿穩定性的 RSD分別為0.66%、0.34%、0.38%、0.11%和0.63%。表明供試品在48 h內穩定。

2.1.8 重復性試驗 稱取黃柏藥材粉末(過4號篩)約0.5 g共6份，精密稱定，按“2.1.3”項下制備樣品，測定，木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿的 RSD分別為1.9%、2.5%、1.3%、1.2%和2.2%。表明該方法重復性好。

2.1.9 加樣回收率試驗 精密稱取0.5 g湖北產黃柏藥材粉末(小檗堿含有量3.81%)6份，加鹽酸-甲醇(1∶100)的混合液40 mL，稱定質量，超聲30 min，冷卻后加鹽酸-甲醇(1∶100)的混合液補足失質量，過濾，取濾液2 mL，加1 mL鹽酸小檗堿(1.007 mg/mL)定容到10 mL，再次超聲30 min(重現提取過程)，0.45μm濾膜過濾，進樣，測定，計算，得加樣回收率分別為97.1%、98.8%、 96.9%、 100.9%、 99.0%、 95.6%、RSD為1.9%。

2.2 校正因子的重現性考察

2.2.1 色譜柱及高效液相色譜儀考察 取“2.1.2”項下混合對照品溶液，進樣20、10、8、6、4、2μL，按“2.1.5”項下計算小檗堿對木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀的校正因子。不同高效液相色譜系統和不同品牌柱子的相對校正因子見表3。

2.2.2 待測組分色譜峰的定位 利用5個成分色譜行為的不同，以小檗堿為基準峰計算各個化合物的相對保留時間，即確定其在色譜圖中的位置。結果見表4。

表3 不同儀器和色譜柱測得相對校正因子Tab.3 RCFs determined by different instruments and columns

表4 不同儀器和色譜柱測得相對保留值Tab.4 Relative retention time(RTR)determined by different instruments and columns

2.3 一測多評法與標準曲線法測定結果的比較按供試品溶液處理方法制備樣品，分別精密吸取供試品溶液各5μL注入高效液相色譜儀測定。采用標準曲線法和一測多評法分別計算黃柏中木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿的量，結果見表5。

測定結果表明，同一樣品中木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿的量差異較大，小檗堿的量最高，部分地區不含或含少量藥根堿和巴馬汀。同時，不同產地黃柏生物堿量差異比較大，川產黃柏小檗堿和黃柏堿量較其他產區高，其中以四川滎經產黃柏含有量最高。

3 討論

實驗過程中，考察了鹽酸-甲醇(1∶100)、乙酸-甲醇(1∶100)、60%乙醇和甲醇4種不同提取溶劑，采用超聲提取30 min，權衡5種成分提取效率，結果以鹽酸-甲醇(1∶100)作為溶劑提取較為完全。同時，考察了乙腈-磷酸鹽溶液作為流動相系統進行分析，其峰型較差，色譜峰重疊，改為乙腈-磷酸二氫鉀(十二烷基硫酸鈉，磷酸調節pH)后，峰型改善，但木蘭花堿和黃柏堿色譜峰重疊，無法得到有效分離。因為將木蘭花堿與黃柏堿、巴馬汀與小檗堿同時有效分離需要不同濃度的有機相和不同pH。因此，考察不同pH不同乙腈濃度的混合流動相作為洗脫劑，最后實驗確定以乙腈-0.05 mol/L KH2PO4(45∶55)(每100 mL中加入0.4 g十二烷基硫酸鈉，調節pH至4.8)為流動相A，乙腈-0.05 mol/L KH2PO4(55∶45)(每100 mL中加入0.4 g十二烷基硫酸鈉，調節pH至4.5)為流動相B，作為流動相，使各成分完全分離，且峰形較好。

表5 標準曲線法和一測多評法測定黃柏中生物堿的比較Tab.5 Contents of alkaloids by external standard method and QAMS

本實驗考察了不同色譜柱、液相色譜系統對小檗堿與木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿和巴馬汀之間相對校正因子的影響，驗證一測多評法在黃柏質量控制中的可行性和技術適應性。標準曲線法和一測多評法測定30批黃柏中生物堿的結果表明，一測多評法與標準曲線法得到的數值之間沒有顯著性差異，說明建立的校正因子具有較好的可信度，一測多評法能同時測定黃柏中小檗堿、木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿和巴馬汀的量。

實驗中，通過對5個成分的吸收光譜并結合3D圖進行分析，選擇280 nm作為檢測波長，5個生物堿都有吸收。黃柏堿及木蘭花堿與另3個生物堿母核結構不同(巴馬汀、藥根堿、小檗堿)，UV響應值也存在不同，但一測多評法利用數學上的轉換關系推算校正因子，并不關乎化學結構是否異同，故而雖然每個成分都不能實現最優的波長檢測，但在一定含有量范圍內仍然是可以實現較為準確的定量。

黃柏中小檗堿與其他生物堿相比含有量差異很大，一次分離測定常導致低含有量成分低于檢測靈敏度或超出線性范圍，很難同時兼顧。同時，多組分定量測定中無法兼顧各組分選用最佳波長，確實會降低各組分的定量限，但在本實驗中的30個樣品中并未受到該因素的影響，相比每個成分單獨測定而言，換來了較高的分析效率。在對照品缺乏的情況下，此方法可以作為一個新模式用于黃柏藥材的多成分定量。

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