機(jī)械拉伸對兔角膜成纖維細(xì)胞增殖和遷移的影響

劉成星，李曉娜，馮鵬飛，安美文，陳維毅

（太原理工大學(xué) 應(yīng)用力學(xué)與生物醫(yī)學(xué)工程研究所，太原 030024）

角膜是影響視覺的重要組織。由于眼壓的波動，人角膜在生理性情況下即發(fā)生周期性變形[1]。眼屈光手術(shù)使角膜受到了一定程度的機(jī)械損傷，也改變了角膜所處的力學(xué)環(huán)境[2]。角膜基質(zhì)細(xì)胞受損后首先發(fā)生凋亡，隨后角膜基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生增殖和遷移，并轉(zhuǎn)化成角膜成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞，對受損角膜進(jìn)行損傷修復(fù)[3]。研究表明，一些細(xì)胞因子如EGF和bFGF在角膜細(xì)胞的增殖和遷移過程中發(fā)揮了重要作用[4-5]；機(jī)械牽拉能夠影響細(xì)胞的增殖[6-7]和遷移[8-9]。而有關(guān)力學(xué)刺激對角膜細(xì)胞的增殖遷移影響尚未見報(bào)道。本文通過對兔角膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行周期性機(jī)械拉伸，探討力學(xué)刺激在角膜成纖維細(xì)胞增殖及遷移中的作用。

1 材料和方法

1.1 兔角膜成纖維細(xì)胞的原代提取、培養(yǎng)

本研究采用酶消化法獲取原代兔角膜成纖維細(xì)胞[10]。首先機(jī)械剝離上皮層和內(nèi)皮層，然后用2 mg／mL的Ⅱ型膠原酶消化組織塊，直至培養(yǎng)液完全清亮，離心后獲得角膜成纖維細(xì)胞，加入胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）體積分?jǐn)?shù)為10%的F12培養(yǎng)基，置于37℃、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)使用2～5代細(xì)胞。

1.2 周期性力學(xué)加載

采用Flexcell4000柔性基底拉伸系統(tǒng)（美國Flexcell）對細(xì)胞實(shí)施周期性機(jī)械拉伸。將角膜成纖維細(xì)胞用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化，以3×105的密度接種于裱襯有I型膠原蛋白的BioFlex＠六孔培養(yǎng)板（美國Flexcell）上，置于孵箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞80%融合時(shí)，進(jìn)行5%拉伸應(yīng)變、0.1Hz正弦波的力學(xué)加載，卸載后進(jìn)行細(xì)胞周期檢測和劃痕實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞周期檢測

用胎牛血清體積分?jǐn)?shù)為10%的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。卸載后12，24，36h收集細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)4℃預(yù)冷、體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇固定，采用細(xì)胞周期檢測試劑盒（南京凱基）通過流式細(xì)胞儀（德國Beckman）對細(xì)胞周期進(jìn)行檢測，用S期（Synthesis phase，DNA合成期）占整個(gè)細(xì)胞周期的百分比表示細(xì)胞增殖情況。S期所占百分比越高，說明細(xì)胞增殖越旺盛。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)

如圖1所示，接種細(xì)胞前，在培養(yǎng)皿底壁外側(cè)用標(biāo)記筆劃十字線。在Flexcell4000加載時(shí)，12.7 mm半徑之內(nèi)（圖1白色區(qū)域）細(xì)胞主要受等雙軸拉伸；半徑12.7～17.8mm范圍內(nèi)（圖1淺灰色環(huán)形區(qū)域），細(xì)胞主要受單軸拉伸[11]。加載前用10μL槍頭在等雙軸拉伸區(qū)域沿與標(biāo)記線垂直方向劃痕，在單軸拉伸區(qū)域沿標(biāo)記線平行方向劃痕。所有劃痕均與力的方向垂直。圖1中短直線代表劃痕，箭頭代表牽張力的方向。

先用FBS體積分?jǐn)?shù)為2%的培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12h，使細(xì)胞周期同步化。劃痕后，用PBS清洗，去除死細(xì)胞，換成FBS體積分?jǐn)?shù)1%的F12培養(yǎng)基。然后添加1ng／mL重構(gòu)人表皮生長因子（rhEGF）或100ng／mL重構(gòu)人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（rhbFGF）（美國PeproTech），以FBS體積分?jǐn)?shù)1%組作為對照。分別于0，5，10，20h拍照，測量各時(shí)刻的劃痕面積，用不同時(shí)間點(diǎn)的劃痕面積除以初始（0h）劃痕面積，獲得與初始面積的百分比。由于所取劃痕長度相同，因此該比值即相對劃痕寬度。相對劃痕寬度越小，說明細(xì)胞遷移速度越快。每個(gè)區(qū)域做8個(gè)劃痕，取均值。

圖1 體外劃痕實(shí)驗(yàn)示意圖

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±S表示。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件中單因素方差分析方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，p＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 周期性機(jī)械拉伸對角膜成纖維細(xì)胞增殖的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，兔角膜成纖維細(xì)胞在12h相對分裂最旺盛，S期占整個(gè)細(xì)胞周期的41.17%；隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，S期占細(xì)胞周期的比例明顯降低，36h下降為19.99%（圖2-a）。與各自靜態(tài)對照組相比，5%拉伸使S期細(xì)胞比例均有所增高。拉伸12h，S期雖為靜態(tài)對照組的1.12倍，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）；拉伸24h和36h時(shí)，S期分別為靜態(tài)對照組的1.22和1.24倍，具有顯著差異（p＜0.05）（圖2-b）。

圖2 體外周期性機(jī)械拉伸對角膜成纖維細(xì)胞增殖的影響

2.2 周期性機(jī)械拉伸對角膜成纖維細(xì)胞遷移的影響

首先我們研究了bFGF與EGF對細(xì)胞遷移的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：無論是拉伸組還是靜態(tài)對照組，相對劃痕寬度均隨時(shí)間增加而減小（圖3至圖5），說明細(xì)胞在損傷后均表現(xiàn)出不同程度的遷移行為。在未拉伸培養(yǎng)條件下，5h時(shí)，與1%FBS對照組相比，施加bFGF或EGF對相對劃痕寬度無明顯影響（p＞0.05）；10h后bFGF或EGF對細(xì)胞遷移行為的影響逐漸顯現(xiàn)，表現(xiàn)為其相對劃痕寬度明顯小于1%FBS對照組（p＜0.05）；拉伸條件下具有同樣趨勢（圖4）。說明bFGF和EFG對細(xì)胞遷移均具有促進(jìn)作用，EFG作用效果略優(yōu)于bFGF，但二者之間無顯著差別（p＞0.05）。

其次，我們研究了拉伸對角膜成纖維細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果表明：實(shí)施5%的周期性拉伸5h，與各自靜態(tài)對照組相比，無論是等雙軸還是單軸拉伸，相對劃痕寬度均無明顯差異（p＞0.05）；10h時(shí)，等雙軸拉伸組相對劃痕寬度雖較各自靜態(tài)對照組有所增加，但二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05），而單軸拉伸組細(xì)胞遷移則明顯受到抑制，表現(xiàn)為相對劃痕寬度顯著大于靜態(tài)對照組（p＜0.05）；20h時(shí)，無論是等雙軸拉伸還是單軸拉伸，拉伸組相對劃痕寬度均明顯大于各自靜態(tài)對照組（p＜0.05）。說明拉伸抑制了角膜成纖維細(xì)胞的遷移，且抑制效應(yīng)具有時(shí)間依賴性，拉伸時(shí)間越長，抑制效應(yīng)越明顯。單軸拉伸對細(xì)胞遷移的抑制效應(yīng)早于且強(qiáng)于等雙軸拉伸。

3 討論

角膜受損后，角膜基質(zhì)由于水腫而發(fā)生膨脹，在傷口邊緣的基質(zhì)細(xì)胞首先發(fā)生凋亡。基質(zhì)細(xì)胞在生長因子和細(xì)胞因子的作用下向傷口處遷移、增殖，并合成各種細(xì)胞外基質(zhì)，對角膜進(jìn)行損傷修復(fù)。因此角膜成纖維細(xì)胞的增殖和遷移對角膜基質(zhì)損傷修復(fù)具有重要意義。

如前所述，角膜本身在眼壓的周期性波動下就受到周期性牽拉的作用，屈光手術(shù)由于對基質(zhì)進(jìn)行了切削則使角膜受到的拉應(yīng)力增大。但有關(guān)機(jī)械拉伸對角膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移的影響目前尚未見報(bào)道。我們通過對兔角膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行周期性機(jī)械拉伸后發(fā)現(xiàn)，低幅度的機(jī)械拉伸能夠促進(jìn)兔角膜成纖維細(xì)胞增殖，但抑制了細(xì)胞遷移行為；bFGF和EGF能夠促進(jìn)細(xì)胞遷移行為，因此一定程度上減弱了由牽拉引起的細(xì)胞遷移抑制效應(yīng)；拉伸方式對遷移行為有影響。

據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，機(jī)械應(yīng)力能夠影響細(xì)胞增殖[6-7]。本研究結(jié)果提示機(jī)械牽拉可以通過促進(jìn)細(xì)胞的增殖來影響角膜成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為，這對損傷后角膜組織早期修復(fù)具有積極意義。如屈光手術(shù)后，少量的基質(zhì)切削造成組織損傷的同時(shí)使角膜拉應(yīng)力增大。在這種情況下，拉應(yīng)力通過促進(jìn)細(xì)胞增殖而有利于損傷后角膜組織的修復(fù)，這種行為是生物體自我保護(hù)的體現(xiàn)。

圖5 單軸周期性拉伸對角膜成纖維細(xì)胞遷移的影響

角膜損傷后上皮細(xì)胞分泌各種細(xì)胞因子和生長因子（如bFGF），并刺激淚腺分泌EGF。角膜成纖維細(xì)胞也可以產(chǎn)生各種生長因子并表達(dá)相應(yīng)受體，其中包括bFGF和EGF及其受體。這些生長因子通過自分泌或旁分泌方式調(diào)節(jié)角膜成纖維細(xì)胞的增殖和遷移行為[12]。研究表明bFGF和EGF均可以促進(jìn)角膜成纖維細(xì)胞遷移，并具有劑量依賴性[4-5]。實(shí)驗(yàn)也證實(shí)施加100ng／mL bFGF或1ng／mL EGF 10h后明顯促進(jìn)了兔角膜成纖維細(xì)胞的遷移。此外，bFGF及EGF還可以減弱由拉伸引起的細(xì)胞遷移抑制行為。如5%等雙軸拉伸20h，bFGF和EGF作用組相對劃痕寬度分別為（44.11±9.81）%和（51.66±5.31）%，與1%FBS靜態(tài)對照組的（46.24±3.91）%相當(dāng)。這說明細(xì)胞生長因子bFGF和EGF能夠使角膜成纖維細(xì)胞在受拉狀態(tài)下保持適宜的遷移速度，從而有利于角膜的損傷修復(fù)。

本研究結(jié)果表明，5%、0.1Hz的周期性機(jī)械拉伸能夠抑制角膜成纖維細(xì)胞的遷移行為。這與Savla U等[8，13-14]的結(jié)果一致。周期性牽拉引起的氣道上皮細(xì)胞遷移行為受抑與FAK-JIP3-JNK（FAK：Focal Adhesion Kinase，局部粘附斑；JIP3：JNK-interacting protein 3，JNK相互作用蛋白3；JNK：c-Jun N-terminal Kinase，c-jun氨基末端激酶）信號途徑有關(guān)[13-14]。而對牛動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞施加5%、1Hz的雙軸周期性牽拉24h，用Transwell小室檢測細(xì)胞的遷移情況則發(fā)現(xiàn)，拉伸能夠促進(jìn)動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，拉伸組遷移細(xì)胞數(shù)目是靜態(tài)對照組的1.83倍[9]。該研究結(jié)果與我們及U.Savla等的結(jié)論相反，這可能與細(xì)胞種類及體外檢測細(xì)胞遷移的方法有關(guān)。Transwell小室主要檢測細(xì)胞在三維基質(zhì)環(huán)境中的遷移行為，細(xì)胞遷移的快慢除與細(xì)胞本身運(yùn)動能力相關(guān)外，還與細(xì)胞分泌的降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白（如基質(zhì)金屬蛋白酶）量有關(guān)。而細(xì)胞體外劃痕實(shí)驗(yàn)，主要考察二維培養(yǎng)條件下細(xì)胞的運(yùn)動變形能力。

此外，研究還發(fā)現(xiàn)角膜成纖維細(xì)胞的遷移行為與力學(xué)載荷的作用方式有關(guān)。單軸拉伸對角膜成纖維細(xì)胞的遷移行為抑制效應(yīng)比等雙軸拉伸明顯。T.A.Hornberger等[15]發(fā)現(xiàn)等雙軸拉伸和單軸拉伸均可以使C2C12細(xì)胞的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）和蛋白激酶B（protein kinase B，PKB／Akt）磷酸化水平增高，但僅等雙軸拉伸可以引起核糖體S6激酶（Ribosomal S6kinase，p70S6k）磷酸化，這提示細(xì)胞對不同方式力學(xué)刺激的信號響應(yīng)機(jī)制不同。

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