超高效液相色譜—串聯質譜法同時測定飼料中3種氯丙那林異構體和巴氯芬

李陽等

摘要：以溶劑提取固相萃取為前處理方式，建立了超高效液相色譜串聯質譜法檢測飼料中3種氯丙那林異構體和巴氯芬的新方法。試樣用0.1 mol/L HCl甲醇（4∶1， V/V）溶劑振蕩提取20 min，離心去雜質后由MCX柱凈化、濃縮，經Waters BEH C18色譜柱梯度洗脫分離，串聯質譜法測定，正離子掃描，并以外標法計算結果。方法檢出限為20 μg/kg，定量限為50 μg/kg。4種目標化合物在3個添加水平上進行回收實驗，回收率均在80%～110%之間；相對標準偏差均小于或等于10.2%。

關鍵詞：飼料； 氯丙那林； 異構體； 巴氯芬； 超高效液相色譜串聯質譜

1引言

氯丙那林（Clorprenaline）屬于β2受體激動劑類藥物，醫學上主要用于擴張支氣管和增加肺通氣量，可治療哮喘和肺炎。將其添加到飼料或動物飲用水中飼喂動物能夠起到提高酮體瘦肉率，促進動物生長的作用[1]，是近年來發現的新型“瘦肉精”替代品[2]。巴氯芬（Baclofen）屬于鎮靜劑類藥物，主要用于骨骼肌松馳，緩解痙攣及外傷等[3]，在畜牧養殖過程中使用能夠抗驚厥、減少動物營養消耗、增加體重，該藥物也是近些年在動物產品安全監管中新發現的違禁添加物。食用含有氯丙那林和巴氯芬的動物產品易出現毒副作用，對人體健康造成一定程度損害。2002年，我國農業部已發布176號公告明令禁止在畜牧養殖過程中使用β2受體激動劑和鎮靜劑類藥物。但是，仍有一些新型藥物被違法添加使用的現象出現。因此，建立相應檢測方法是很有必要的。

目前，關于氯丙那林和巴氯芬的檢測方法已有報道，實驗樣品主要有飼料[4]、血清[5]、尿液[6]、組織[7]、原料藥[8]、牛奶[9]等。色譜法是主要的分離方法，包括反相液相色譜法[1，2，5，8，9]、離子色譜法[10]、氣相色譜法[11]以及毛細管電泳法[12]等。常用的檢測器包括熒光檢測器[12，13]、紫外檢測器[1，8，13]、電導檢測器[10]及質譜[5～7，9，11，14]等。在飼料中違禁藥物監測過程中，經常應用單四級桿質譜進行非針對性篩查，以發現違禁添加物。由于氯丙那林和巴氯芬的理論分子量分別為213.7069和213.6635（由Waters Masslynx 4.1 Molecular calculator計算得到），二者數值接近，如果應用一級質譜篩查，則難以對二者進行準確定性。此外，氯丙那林含有苯環一氯取代結構，存在鄰、間、對位置異構體，在色譜分離上有不同保留時間的差異，如果只應用其中一種異構體的保留時間進行確證，容易將異構體判定為非目標化合物，給違禁藥物監管帶來漏洞。圖1為巴氯芬和3種氯丙那林異構體結構式。本研究采用溶劑提取后，經固相萃取凈化、濃縮，反相液相色譜串聯質譜測定，通過優化前處理方法以及儀器檢測參數，建立了針對巴氯芬和3種氯丙那林異構體的檢測方法。本方法適用于飼料實際樣品分析，結果準確、靈敏。

3結果與討論

3.1質譜和色譜條件優化

氯丙那林為β2受體激動劑類藥物，屬于堿性化合物，pKa>7[15]；巴氯芬為酸堿兩性化合物，在水中pKa值為3.87和9.62[16]。4種目標化合物均可采用正離子電離模式和反相液相色譜分離。通常向流動相中添加適量甲酸將有助于堿性物質電離，并使目標化合物色譜柱保留時間提前。在此基礎上，本研究分別采用乙腈0.1%甲酸、乙腈水、甲醇0.1%甲酸、甲醇水作為流動相，考察Acquity Uplc BEH C18和Acquity Uplc shield RP 18色譜柱對目標化合物色譜分離及質譜電離的影響。結果表明，流動相中添加甲酸后待測物質的信號強度明顯提高，甲醇和乙腈作為流動相對信號強度影響并不顯著。但使用乙腈時，間位氯丙那林和對位氯丙那林異構體分離度較差（圖2A）。Acquity Uplc BEH C18和Acquity Uplc shield RP 18色譜柱對4種化合物均能實現基線分離，與后者相比，4種化合物在Acquity Uplc BEH C18上保留時間相對較長，巴氯芬與3種氯丙那林異構體更好地實現分離，去雜能力更強。圖2C為使用Acquity Uplc BEH C18的分離效果圖，圖2B為使用Acquity Uplc shield RP 18色譜柱分離效果圖。綜合考慮檢測時間、分離效果以及試劑毒性等因素，本研究采用甲醇0.1%甲酸溶液作為流動相，Acquity Uplc BEH C18色譜柱作為色譜條件。圖2定量離子提取離子色譜圖中4種化合物濃度均為1.0 μg/L。

質譜條件優化過程中，首先采用濃度為1.0 mg/L上述4種待測目標化合物標準溶液分別上機測定。在正離子模式下，進行母離子全掃描。確定分子離子，并對儀器電離電壓、錐孔電壓、碰撞能量等參數進行優化，確定兩個子離子作為定性離子，并選擇其中之一作為定量離子。

3.2樣品前處理條件優化

氯丙那林和巴氯芬均具有弱堿性，在酸性條件下帶正電，易被水、水溶性溶劑或它們的混合溶劑提取。提取液pH值和有機溶劑比例是影響提取效率的兩大因素。本研究對比了添加濃度為50 μg/kg水平下，3種濃度HCl溶液混合不同比例甲醇的提取效果。圖3為不同提取條件下的平均回收率，當提取條件為0.1 mol/L HCl甲醇（4∶1， V/V）時，目標化合物的回收率綜合水平較高，均在85%～110%之間。由4種目標化合物回收率隨HCl濃度及有機相比例變化趨勢圖可見，4種目標化合物在有機相比例為20%～50%范圍內，回收率均較高，證明添加適量有機溶劑有助于目標物提取。當有機相比例小于50%時，HCl濃度對3種氯丙那林異構體回收率影響較大，回收率隨HCl濃度增大而提高；但在此范圍內，HCl濃度對巴氯芬回收率影響較小。當有機相比例大于50%時，隨著有機相比例增加，目標化合物回收率呈下降趨勢。當提取液為100%甲醇時，4種目標化合物回收率均較低。

本研究比較了C18柱、HLB柱、MCX柱、WCX柱的不同凈化效果。結果表明，WCX柱對目標化合物保留效果較差，C18柱、HLB凈化后雜質較多，基質效應較大。由于MCX柱是利用陽離子交換作用保留目標化合物，待測的4種化合物均為堿性化合物，pKa>7，在酸性條件下帶正電，MCX對其柱具有較好的吸附作用。甲酸和甲醇不能將目標化合物洗脫，但能達到洗脫極性和非極性雜質的作用，所以選擇甲酸和甲醇作為淋洗溶液。氨化甲醇是MCX柱常用的洗脫溶劑，為保證目標化合物完全被洗脫，本研究采用了5% 氨化甲醇溶液，洗脫體積為5.0 mL。綜合以上條件， 選擇0.1 mol/L HCl甲醇（4∶1， V/V）為樣品提取溶液，經MCX柱保留后，使用0.2%甲酸和甲醇淋洗雜質，再用5%氨化甲醇洗脫，洗脫液雜質少，并且容易吹干，有很好的凈化和濃縮效果。

3.3基質效應考察

采用提取后添加法定量測定空白基質提取液與純溶劑中同濃度分析物的離子響應強度，通過公式ME（%）=基質溶液中分析物峰面積/純溶劑中分析物峰面積，分別在3個不同濃度下評價基質效應。ME<1，基質對目標化合物的響應產生抑制作用；ME>1，基質對目標化合物的響應產生增強作用；ME=1，不存在基質效應。如圖4所示，樣品基質對4種分析物均有一定程度抑制作用，但在3個濃度水平下，ME均在80%～100%范圍內，表明本研究所建立前處理方法去雜質效果較好。因此，可以采用純溶劑標準溶液進行定量計算。

3.6實際樣品檢測

利用本方法對收集的21份飼料實際樣品進行了檢測（包括豬配合飼料5份，小、中、大豬用濃縮飼料6份，肉牛濃縮飼料2份，肉牛精料補充料2份，肉羊專用濃縮飼料2份，肉羊專用精料補充料2份，兔全價配合飼料2份），所有樣品中均未檢出4種目標化合物。

References

1Yan H Y， Liu S T， Gao M M， Sun N. J. Chromatogr. A， 2013， 1294 ： 10-16

2CAO Ying， HUANG ShiXin， LI DanNi. Chinese Journal of Veterinary Drug， 2007， 41（12）： 30-32

3Vienne J， Bettler B， Franken P， Tafti M. The Journal of Neuroscience.， 2010， 30（42）： 14194-14204

4Zhang G J， Fang B H， Liu Y H， Wang X F， Xu L X， Zhang Y P， He L M. J. Chromatogr. B， 2013， 936： 10-17

5MiksaI R， Poppenga R H. Journal of Analytical Toxicology.， 2003， 27（5）： 275-283

6Du X D， Wy Y L， Yang H J， Yang T. J. Chromatogr. A， 2012， 1260： 25-32

7Wang L Q， He L M， Wang Z， Wang X F， Shu J H，Yang J W， Zhang G K， Zeng Z L. Analyst， 2013， 138（16）： 4579-4584

8Nalluri B N， Sushmitha K， Sunandana B， Babu D P. Journal of Applied Pharmaceutical Science.， 2012， 02（07）： 111-116

9YANG Fang， LIU ZhenCai， LIN YongHui， CHEN Jian， PANG GuoFang， CHEN GuoNan. Food Anal. Methods.， 2012， 5： 138-147

10SHEN S H， OUYANG J， Baeyensb W R C， Delanghec J R， YANG Y P. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis.， 2005， 38（1）： 166-172

11WANG PeiLong， FAN Li， SU XiaoOu， YE ZhiHua. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（3）： 470-473

12CAO LiWei， LI Cong， REN Dong. Journal of Jinan University（Natural Science）.， 2011， 32（5）： 485-488

13Cao L W， LI C. Acta Chromatographica， 2012， 24（3）： 383-397

14FAN S， MIAO H， ZHAO Y F， CHEN H J， WU Y N. J. Agric. Food Chem.， 2012， 60（8）： 1898-1905

15LI JunSuo， QIU YueMing， WANG Chao. Residue Analysis for Veterinary Drug. Shanghai： Shanghai Scientific & Technical Publishers， 2002： 641-644

16VaccherM P， Lipka E， Bonte J P， Vaccher C. Electrophoresis.， 2004， 25： 1111-1120

本研究比較了C18柱、HLB柱、MCX柱、WCX柱的不同凈化效果。結果表明，WCX柱對目標化合物保留效果較差，C18柱、HLB凈化后雜質較多，基質效應較大。由于MCX柱是利用陽離子交換作用保留目標化合物，待測的4種化合物均為堿性化合物，pKa>7，在酸性條件下帶正電，MCX對其柱具有較好的吸附作用。甲酸和甲醇不能將目標化合物洗脫，但能達到洗脫極性和非極性雜質的作用，所以選擇甲酸和甲醇作為淋洗溶液。氨化甲醇是MCX柱常用的洗脫溶劑，為保證目標化合物完全被洗脫，本研究采用了5% 氨化甲醇溶液，洗脫體積為5.0 mL。綜合以上條件， 選擇0.1 mol/L HCl甲醇（4∶1， V/V）為樣品提取溶液，經MCX柱保留后，使用0.2%甲酸和甲醇淋洗雜質，再用5%氨化甲醇洗脫，洗脫液雜質少，并且容易吹干，有很好的凈化和濃縮效果。

3.3基質效應考察

采用提取后添加法定量測定空白基質提取液與純溶劑中同濃度分析物的離子響應強度，通過公式ME（%）=基質溶液中分析物峰面積/純溶劑中分析物峰面積，分別在3個不同濃度下評價基質效應。ME<1，基質對目標化合物的響應產生抑制作用；ME>1，基質對目標化合物的響應產生增強作用；ME=1，不存在基質效應。如圖4所示，樣品基質對4種分析物均有一定程度抑制作用，但在3個濃度水平下，ME均在80%～100%范圍內，表明本研究所建立前處理方法去雜質效果較好。因此，可以采用純溶劑標準溶液進行定量計算。

3.6實際樣品檢測

利用本方法對收集的21份飼料實際樣品進行了檢測（包括豬配合飼料5份，小、中、大豬用濃縮飼料6份，肉牛濃縮飼料2份，肉牛精料補充料2份，肉羊專用濃縮飼料2份，肉羊專用精料補充料2份，兔全價配合飼料2份），所有樣品中均未檢出4種目標化合物。

References

1Yan H Y， Liu S T， Gao M M， Sun N. J. Chromatogr. A， 2013， 1294 ： 10-16

2CAO Ying， HUANG ShiXin， LI DanNi. Chinese Journal of Veterinary Drug， 2007， 41（12）： 30-32

3Vienne J， Bettler B， Franken P， Tafti M. The Journal of Neuroscience.， 2010， 30（42）： 14194-14204

4Zhang G J， Fang B H， Liu Y H， Wang X F， Xu L X， Zhang Y P， He L M. J. Chromatogr. B， 2013， 936： 10-17

5MiksaI R， Poppenga R H. Journal of Analytical Toxicology.， 2003， 27（5）： 275-283

6Du X D， Wy Y L， Yang H J， Yang T. J. Chromatogr. A， 2012， 1260： 25-32

7Wang L Q， He L M， Wang Z， Wang X F， Shu J H，Yang J W， Zhang G K， Zeng Z L. Analyst， 2013， 138（16）： 4579-4584

8Nalluri B N， Sushmitha K， Sunandana B， Babu D P. Journal of Applied Pharmaceutical Science.， 2012， 02（07）： 111-116

9YANG Fang， LIU ZhenCai， LIN YongHui， CHEN Jian， PANG GuoFang， CHEN GuoNan. Food Anal. Methods.， 2012， 5： 138-147

10SHEN S H， OUYANG J， Baeyensb W R C， Delanghec J R， YANG Y P. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis.， 2005， 38（1）： 166-172

11WANG PeiLong， FAN Li， SU XiaoOu， YE ZhiHua. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（3）： 470-473

12CAO LiWei， LI Cong， REN Dong. Journal of Jinan University（Natural Science）.， 2011， 32（5）： 485-488

13Cao L W， LI C. Acta Chromatographica， 2012， 24（3）： 383-397

14FAN S， MIAO H， ZHAO Y F， CHEN H J， WU Y N. J. Agric. Food Chem.， 2012， 60（8）： 1898-1905

15LI JunSuo， QIU YueMing， WANG Chao. Residue Analysis for Veterinary Drug. Shanghai： Shanghai Scientific & Technical Publishers， 2002： 641-644

16VaccherM P， Lipka E， Bonte J P， Vaccher C. Electrophoresis.， 2004， 25： 1111-1120

本研究比較了C18柱、HLB柱、MCX柱、WCX柱的不同凈化效果。結果表明，WCX柱對目標化合物保留效果較差，C18柱、HLB凈化后雜質較多，基質效應較大。由于MCX柱是利用陽離子交換作用保留目標化合物，待測的4種化合物均為堿性化合物，pKa>7，在酸性條件下帶正電，MCX對其柱具有較好的吸附作用。甲酸和甲醇不能將目標化合物洗脫，但能達到洗脫極性和非極性雜質的作用，所以選擇甲酸和甲醇作為淋洗溶液。氨化甲醇是MCX柱常用的洗脫溶劑，為保證目標化合物完全被洗脫，本研究采用了5% 氨化甲醇溶液，洗脫體積為5.0 mL。綜合以上條件， 選擇0.1 mol/L HCl甲醇（4∶1， V/V）為樣品提取溶液，經MCX柱保留后，使用0.2%甲酸和甲醇淋洗雜質，再用5%氨化甲醇洗脫，洗脫液雜質少，并且容易吹干，有很好的凈化和濃縮效果。

3.3基質效應考察

采用提取后添加法定量測定空白基質提取液與純溶劑中同濃度分析物的離子響應強度，通過公式ME（%）=基質溶液中分析物峰面積/純溶劑中分析物峰面積，分別在3個不同濃度下評價基質效應。ME<1，基質對目標化合物的響應產生抑制作用；ME>1，基質對目標化合物的響應產生增強作用；ME=1，不存在基質效應。如圖4所示，樣品基質對4種分析物均有一定程度抑制作用，但在3個濃度水平下，ME均在80%～100%范圍內，表明本研究所建立前處理方法去雜質效果較好。因此，可以采用純溶劑標準溶液進行定量計算。

3.6實際樣品檢測

利用本方法對收集的21份飼料實際樣品進行了檢測（包括豬配合飼料5份，小、中、大豬用濃縮飼料6份，肉牛濃縮飼料2份，肉牛精料補充料2份，肉羊專用濃縮飼料2份，肉羊專用精料補充料2份，兔全價配合飼料2份），所有樣品中均未檢出4種目標化合物。

References

1Yan H Y， Liu S T， Gao M M， Sun N. J. Chromatogr. A， 2013， 1294 ： 10-16

2CAO Ying， HUANG ShiXin， LI DanNi. Chinese Journal of Veterinary Drug， 2007， 41（12）： 30-32

3Vienne J， Bettler B， Franken P， Tafti M. The Journal of Neuroscience.， 2010， 30（42）： 14194-14204

4Zhang G J， Fang B H， Liu Y H， Wang X F， Xu L X， Zhang Y P， He L M. J. Chromatogr. B， 2013， 936： 10-17

5MiksaI R， Poppenga R H. Journal of Analytical Toxicology.， 2003， 27（5）： 275-283

6Du X D， Wy Y L， Yang H J， Yang T. J. Chromatogr. A， 2012， 1260： 25-32

7Wang L Q， He L M， Wang Z， Wang X F， Shu J H，Yang J W， Zhang G K， Zeng Z L. Analyst， 2013， 138（16）： 4579-4584

8Nalluri B N， Sushmitha K， Sunandana B， Babu D P. Journal of Applied Pharmaceutical Science.， 2012， 02（07）： 111-116

9YANG Fang， LIU ZhenCai， LIN YongHui， CHEN Jian， PANG GuoFang， CHEN GuoNan. Food Anal. Methods.， 2012， 5： 138-147

10SHEN S H， OUYANG J， Baeyensb W R C， Delanghec J R， YANG Y P. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis.， 2005， 38（1）： 166-172

11WANG PeiLong， FAN Li， SU XiaoOu， YE ZhiHua. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（3）： 470-473

12CAO LiWei， LI Cong， REN Dong. Journal of Jinan University（Natural Science）.， 2011， 32（5）： 485-488

13Cao L W， LI C. Acta Chromatographica， 2012， 24（3）： 383-397

14FAN S， MIAO H， ZHAO Y F， CHEN H J， WU Y N. J. Agric. Food Chem.， 2012， 60（8）： 1898-1905

15LI JunSuo， QIU YueMing， WANG Chao. Residue Analysis for Veterinary Drug. Shanghai： Shanghai Scientific & Technical Publishers， 2002： 641-644

16VaccherM P， Lipka E， Bonte J P， Vaccher C. Electrophoresis.， 2004， 25： 1111-1120