運用液相色譜聯合離子阱—飛行時間質譜法進行海洛因成癮人員代謝組學研究

吳明健等

摘要：利用代謝組學的研究方法，對海洛因成癮人員尿液及血清中可能的相關標志物進行篩選。運用液相色譜聯合離子阱飛行時間質譜（LC/MSITTOF）聯用技術對海洛因檢測尿檢條陰性的16名海洛因濫用成癮者與16名正常人的血清和尿液進行研究。多變量統計分析結果表明，海洛因成癮者和正常人聚類明顯，血清和尿液中分別發現12種可能的潛在標志物。成癮人員和正常人員在血清及尿液代謝水平上具有明顯差異，差異代謝物的發現有助于為發現海洛因成癮判定的潛在標志物提供依據。

關鍵詞：海洛因； 代謝組學； 液相色譜聯合離子阱飛行時間質譜

1引言

吸毒成癮的科學判定一直是困擾廣大緝毒及相關工作者的一大難題。近年來，毒品分析研究人員試圖通過提高生物樣本的前處理效率、提高儀器的檢測靈敏度及借助多種先進的分析手段來解決此難題，但均未取得突破性的進展。代謝組學是20世紀90年代中期發展起來的，是通過對分子量小于1000 Da的內源性小分子代謝物進行定性與定量分析，揭示這些內源性小分子代謝物與毒性、疾病、生命活動規律等的相互關系的一門新興科學[1～3]。代謝組學一經提出，便受到廣泛關注，并已在很多領域得到廣泛研究[4～7]，但在法庭科學領域進行代謝組學研究罕見報道。本研究將代謝組學的研究方法引入到毒品濫用領域中，為上述難題的解決提供了新的思路，毒品的代謝組學研究有望將毒品鑒定的時限延長，為停止吸毒一段時間后吸毒史的鑒定提供可能。

2實驗部分

2.1儀器、試劑與材料

LC/MSITTOF（日本島津公司）；渦旋混合器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）； MIKRO 22R 臺式高速冷凍離心機（德國Labwar Science公司）。

乙腈、甲醇及甲酸（HPLC級，Dikma公司），其它試劑均為市售分析純。超純水（18 MΩ cm）由本實驗室PURELAB UHQ超純水系統（ELGA Labwater公司）制備。海洛因檢測試劑盒（MOR）購自公安部物證鑒定中心。所有血清和尿液樣品來自16例海洛因濫用成癮者（吸食毒品后3日）和16例健康志

3結果與討論

3.1海洛因濫用成癮人員血清代謝組學研究多變量統計分析結果

代謝組學研究中數據分析過程應用的主要手段為模識別技術，包括非監督方法和有監督方法[8 ， 9]。主成分分析法（PCA）為非監督法，用于考察正常組和海洛因濫用組人員尿液中的代謝物是否有差異，并找出代謝差異。模型質量用R2Y（cum）和Q2（cum）兩個參數評估，R2Y（cum）表示模型的解釋能力，Q2（cum）表示模型的預測能力。用PCA法建模后，自動篩選出具有代表性意義的兩個主成分，這兩個主成分的累積貢獻率R2X（cum）為0.629，即模型解釋了 62.9% 的原始數據，Q2（cum）為0.564即模型的預測能力為56.4%。從 PCA 的得分矩陣投影圖（圖 1） 可見，成癮組和正常組聚成兩類，分類明顯。同時進行了有監督的模式識別方法，偏最小二乘分析方法（PLSDA ）進行數據處理。PLSDA 可以根據樣品分類信息尋找能夠使不同種類的樣品得到最大分離的方向。分析結果表明，兩組之間得到完全分離，海洛因濫用成癮組內源性代謝物與正常組存在明顯差異（圖2），其中 99.8%的樣本符合模型判別即R2Y（cum）= 0.998 ，而模型的預測能Q2（cum）為0.994。

3.3血清和尿液的整合分析

血清和尿液的數據整合起來進行PCA建模，結果如圖5所示。模型參數R2Y（cum）和Q2（cum）值為0.682和0.595，均大于建立在同種分析方法下分析一種樣品的模型參數。這說明了兩種樣品的整合分析，分類效果更好、預測能力更佳。血清樣本組與尿液樣本組比較，血清樣本組能完全區分開，聚類效果更佳明顯，即血清樣本可能更適用于本研究。

4結論

本研究考察了海洛因濫用成癮者血清中可能的潛在標志物，并對尿液中的潛在標志物也進行了篩選。毒品尿液樣本的檢測時限一般為2～3 d，超過這個時限，現有檢測方法很難檢測出毒品及其中間代謝產物，本研究所選海洛因濫用成癮樣本均為海洛因檢測試劑盒（尿）陰性，即超出了毒品檢測的時限。本實驗結果表明，成癮組與正常組仍可得到很好的區分開，說明本方法可延長毒品檢出的時限性。在發現海洛因濫用成癮可能的潛在標志物方面，24種內源性代謝物對成癮者和正常人分類起了最主要作用。上述實驗結果表明了代謝組學在毒品濫用研究領域方面的可行性和潛在的價值，豐富了代謝組學技術的應用領域，為海洛因濫用成癮的科學判定提供了一種新思路。

References

1Nicholson J K， Lindon J C， Holmes E. Xenobiotica， 1999， 29（11）： 1181-1189

2Fiehn O. Comp. Funct. Genomics， 2001， 2（3）： 155-168

3WUMingjian， WANG Mei， YANG Ruiqin， ZHANG Daming. Chinese Journal of Forensic Medicine， 2013， 1（28）： 37-40

4Van der Kloet F M，Tempels F W， Ismail N. J. Metabolomics， 2012， 8（1）： 109-119

5Okazaki Y， Saito K. J. Plant Biotechnol. Rep.， 2012， 6（1）： 1-15

6Lu Y H， Hao H P， Wang G J. J. Clin. Pharmacol. Ther.， 2007， 12（10）： 1144-1150

7West P R， Weir A M， Smith A M. J. Toxicol. Ap. Pharmacol.， 2010， 247（1）： 18-27

8Trygg J， Holmes E， Lundstedt T. J. Proteome Res， 2007， 6（2）： 469-479

9Eriksson L， Antti H， Gottfries J， Holmes E， Johansson E. J. Anal. Bioanal. Chem.， 2004， 380（3）： 419-429

10Chong I G， Jun C H. Chemometrics Intellig Lab Syst， 2005， 78（12）： 103-112

摘要：利用代謝組學的研究方法，對海洛因成癮人員尿液及血清中可能的相關標志物進行篩選。運用液相色譜聯合離子阱飛行時間質譜（LC/MSITTOF）聯用技術對海洛因檢測尿檢條陰性的16名海洛因濫用成癮者與16名正常人的血清和尿液進行研究。多變量統計分析結果表明，海洛因成癮者和正常人聚類明顯，血清和尿液中分別發現12種可能的潛在標志物。成癮人員和正常人員在血清及尿液代謝水平上具有明顯差異，差異代謝物的發現有助于為發現海洛因成癮判定的潛在標志物提供依據。

關鍵詞：海洛因； 代謝組學； 液相色譜聯合離子阱飛行時間質譜

1引言

吸毒成癮的科學判定一直是困擾廣大緝毒及相關工作者的一大難題。近年來，毒品分析研究人員試圖通過提高生物樣本的前處理效率、提高儀器的檢測靈敏度及借助多種先進的分析手段來解決此難題，但均未取得突破性的進展。代謝組學是20世紀90年代中期發展起來的，是通過對分子量小于1000 Da的內源性小分子代謝物進行定性與定量分析，揭示這些內源性小分子代謝物與毒性、疾病、生命活動規律等的相互關系的一門新興科學[1～3]。代謝組學一經提出，便受到廣泛關注，并已在很多領域得到廣泛研究[4～7]，但在法庭科學領域進行代謝組學研究罕見報道。本研究將代謝組學的研究方法引入到毒品濫用領域中，為上述難題的解決提供了新的思路，毒品的代謝組學研究有望將毒品鑒定的時限延長，為停止吸毒一段時間后吸毒史的鑒定提供可能。

2實驗部分

2.1儀器、試劑與材料

LC/MSITTOF（日本島津公司）；渦旋混合器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）； MIKRO 22R 臺式高速冷凍離心機（德國Labwar Science公司）。

乙腈、甲醇及甲酸（HPLC級，Dikma公司），其它試劑均為市售分析純。超純水（18 MΩ cm）由本實驗室PURELAB UHQ超純水系統（ELGA Labwater公司）制備。海洛因檢測試劑盒（MOR）購自公安部物證鑒定中心。所有血清和尿液樣品來自16例海洛因濫用成癮者（吸食毒品后3日）和16例健康志

3結果與討論

3.1海洛因濫用成癮人員血清代謝組學研究多變量統計分析結果

代謝組學研究中數據分析過程應用的主要手段為模識別技術，包括非監督方法和有監督方法[8 ， 9]。主成分分析法（PCA）為非監督法，用于考察正常組和海洛因濫用組人員尿液中的代謝物是否有差異，并找出代謝差異。模型質量用R2Y（cum）和Q2（cum）兩個參數評估，R2Y（cum）表示模型的解釋能力，Q2（cum）表示模型的預測能力。用PCA法建模后，自動篩選出具有代表性意義的兩個主成分，這兩個主成分的累積貢獻率R2X（cum）為0.629，即模型解釋了 62.9% 的原始數據，Q2（cum）為0.564即模型的預測能力為56.4%。從 PCA 的得分矩陣投影圖（圖 1） 可見，成癮組和正常組聚成兩類，分類明顯。同時進行了有監督的模式識別方法，偏最小二乘分析方法（PLSDA ）進行數據處理。PLSDA 可以根據樣品分類信息尋找能夠使不同種類的樣品得到最大分離的方向。分析結果表明，兩組之間得到完全分離，海洛因濫用成癮組內源性代謝物與正常組存在明顯差異（圖2），其中 99.8%的樣本符合模型判別即R2Y（cum）= 0.998 ，而模型的預測能Q2（cum）為0.994。

3.3血清和尿液的整合分析

血清和尿液的數據整合起來進行PCA建模，結果如圖5所示。模型參數R2Y（cum）和Q2（cum）值為0.682和0.595，均大于建立在同種分析方法下分析一種樣品的模型參數。這說明了兩種樣品的整合分析，分類效果更好、預測能力更佳。血清樣本組與尿液樣本組比較，血清樣本組能完全區分開，聚類效果更佳明顯，即血清樣本可能更適用于本研究。

4結論

本研究考察了海洛因濫用成癮者血清中可能的潛在標志物，并對尿液中的潛在標志物也進行了篩選。毒品尿液樣本的檢測時限一般為2～3 d，超過這個時限，現有檢測方法很難檢測出毒品及其中間代謝產物，本研究所選海洛因濫用成癮樣本均為海洛因檢測試劑盒（尿）陰性，即超出了毒品檢測的時限。本實驗結果表明，成癮組與正常組仍可得到很好的區分開，說明本方法可延長毒品檢出的時限性。在發現海洛因濫用成癮可能的潛在標志物方面，24種內源性代謝物對成癮者和正常人分類起了最主要作用。上述實驗結果表明了代謝組學在毒品濫用研究領域方面的可行性和潛在的價值，豐富了代謝組學技術的應用領域，為海洛因濫用成癮的科學判定提供了一種新思路。

References

1Nicholson J K， Lindon J C， Holmes E. Xenobiotica， 1999， 29（11）： 1181-1189

2Fiehn O. Comp. Funct. Genomics， 2001， 2（3）： 155-168

3WUMingjian， WANG Mei， YANG Ruiqin， ZHANG Daming. Chinese Journal of Forensic Medicine， 2013， 1（28）： 37-40

4Van der Kloet F M，Tempels F W， Ismail N. J. Metabolomics， 2012， 8（1）： 109-119

5Okazaki Y， Saito K. J. Plant Biotechnol. Rep.， 2012， 6（1）： 1-15

6Lu Y H， Hao H P， Wang G J. J. Clin. Pharmacol. Ther.， 2007， 12（10）： 1144-1150

7West P R， Weir A M， Smith A M. J. Toxicol. Ap. Pharmacol.， 2010， 247（1）： 18-27

8Trygg J， Holmes E， Lundstedt T. J. Proteome Res， 2007， 6（2）： 469-479

9Eriksson L， Antti H， Gottfries J， Holmes E， Johansson E. J. Anal. Bioanal. Chem.， 2004， 380（3）： 419-429

10Chong I G， Jun C H. Chemometrics Intellig Lab Syst， 2005， 78（12）： 103-112

摘要：利用代謝組學的研究方法，對海洛因成癮人員尿液及血清中可能的相關標志物進行篩選。運用液相色譜聯合離子阱飛行時間質譜（LC/MSITTOF）聯用技術對海洛因檢測尿檢條陰性的16名海洛因濫用成癮者與16名正常人的血清和尿液進行研究。多變量統計分析結果表明，海洛因成癮者和正常人聚類明顯，血清和尿液中分別發現12種可能的潛在標志物。成癮人員和正常人員在血清及尿液代謝水平上具有明顯差異，差異代謝物的發現有助于為發現海洛因成癮判定的潛在標志物提供依據。

關鍵詞：海洛因； 代謝組學； 液相色譜聯合離子阱飛行時間質譜

1引言

吸毒成癮的科學判定一直是困擾廣大緝毒及相關工作者的一大難題。近年來，毒品分析研究人員試圖通過提高生物樣本的前處理效率、提高儀器的檢測靈敏度及借助多種先進的分析手段來解決此難題，但均未取得突破性的進展。代謝組學是20世紀90年代中期發展起來的，是通過對分子量小于1000 Da的內源性小分子代謝物進行定性與定量分析，揭示這些內源性小分子代謝物與毒性、疾病、生命活動規律等的相互關系的一門新興科學[1～3]。代謝組學一經提出，便受到廣泛關注，并已在很多領域得到廣泛研究[4～7]，但在法庭科學領域進行代謝組學研究罕見報道。本研究將代謝組學的研究方法引入到毒品濫用領域中，為上述難題的解決提供了新的思路，毒品的代謝組學研究有望將毒品鑒定的時限延長，為停止吸毒一段時間后吸毒史的鑒定提供可能。

2實驗部分

2.1儀器、試劑與材料

LC/MSITTOF（日本島津公司）；渦旋混合器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）； MIKRO 22R 臺式高速冷凍離心機（德國Labwar Science公司）。

乙腈、甲醇及甲酸（HPLC級，Dikma公司），其它試劑均為市售分析純。超純水（18 MΩ cm）由本實驗室PURELAB UHQ超純水系統（ELGA Labwater公司）制備。海洛因檢測試劑盒（MOR）購自公安部物證鑒定中心。所有血清和尿液樣品來自16例海洛因濫用成癮者（吸食毒品后3日）和16例健康志

3結果與討論

3.1海洛因濫用成癮人員血清代謝組學研究多變量統計分析結果

代謝組學研究中數據分析過程應用的主要手段為模識別技術，包括非監督方法和有監督方法[8 ， 9]。主成分分析法（PCA）為非監督法，用于考察正常組和海洛因濫用組人員尿液中的代謝物是否有差異，并找出代謝差異。模型質量用R2Y（cum）和Q2（cum）兩個參數評估，R2Y（cum）表示模型的解釋能力，Q2（cum）表示模型的預測能力。用PCA法建模后，自動篩選出具有代表性意義的兩個主成分，這兩個主成分的累積貢獻率R2X（cum）為0.629，即模型解釋了 62.9% 的原始數據，Q2（cum）為0.564即模型的預測能力為56.4%。從 PCA 的得分矩陣投影圖（圖 1） 可見，成癮組和正常組聚成兩類，分類明顯。同時進行了有監督的模式識別方法，偏最小二乘分析方法（PLSDA ）進行數據處理。PLSDA 可以根據樣品分類信息尋找能夠使不同種類的樣品得到最大分離的方向。分析結果表明，兩組之間得到完全分離，海洛因濫用成癮組內源性代謝物與正常組存在明顯差異（圖2），其中 99.8%的樣本符合模型判別即R2Y（cum）= 0.998 ，而模型的預測能Q2（cum）為0.994。

3.3血清和尿液的整合分析

血清和尿液的數據整合起來進行PCA建模，結果如圖5所示。模型參數R2Y（cum）和Q2（cum）值為0.682和0.595，均大于建立在同種分析方法下分析一種樣品的模型參數。這說明了兩種樣品的整合分析，分類效果更好、預測能力更佳。血清樣本組與尿液樣本組比較，血清樣本組能完全區分開，聚類效果更佳明顯，即血清樣本可能更適用于本研究。

4結論

本研究考察了海洛因濫用成癮者血清中可能的潛在標志物，并對尿液中的潛在標志物也進行了篩選。毒品尿液樣本的檢測時限一般為2～3 d，超過這個時限，現有檢測方法很難檢測出毒品及其中間代謝產物，本研究所選海洛因濫用成癮樣本均為海洛因檢測試劑盒（尿）陰性，即超出了毒品檢測的時限。本實驗結果表明，成癮組與正常組仍可得到很好的區分開，說明本方法可延長毒品檢出的時限性。在發現海洛因濫用成癮可能的潛在標志物方面，24種內源性代謝物對成癮者和正常人分類起了最主要作用。上述實驗結果表明了代謝組學在毒品濫用研究領域方面的可行性和潛在的價值，豐富了代謝組學技術的應用領域，為海洛因濫用成癮的科學判定提供了一種新思路。

References

1Nicholson J K， Lindon J C， Holmes E. Xenobiotica， 1999， 29（11）： 1181-1189

2Fiehn O. Comp. Funct. Genomics， 2001， 2（3）： 155-168

3WUMingjian， WANG Mei， YANG Ruiqin， ZHANG Daming. Chinese Journal of Forensic Medicine， 2013， 1（28）： 37-40

4Van der Kloet F M，Tempels F W， Ismail N. J. Metabolomics， 2012， 8（1）： 109-119

5Okazaki Y， Saito K. J. Plant Biotechnol. Rep.， 2012， 6（1）： 1-15

6Lu Y H， Hao H P， Wang G J. J. Clin. Pharmacol. Ther.， 2007， 12（10）： 1144-1150

7West P R， Weir A M， Smith A M. J. Toxicol. Ap. Pharmacol.， 2010， 247（1）： 18-27

8Trygg J， Holmes E， Lundstedt T. J. Proteome Res， 2007， 6（2）： 469-479

9Eriksson L， Antti H， Gottfries J， Holmes E， Johansson E. J. Anal. Bioanal. Chem.， 2004， 380（3）： 419-429

10Chong I G， Jun C H. Chemometrics Intellig Lab Syst， 2005， 78（12）： 103-112