基于LTQ—Orbitrap液相色譜—質譜聯用技術的乳源乳清蛋白組分的差異性研究

徐明芳等

摘要：利用LTQ Orbitrap XL組合型傅立葉變換高分辨質譜系統分析了乳源蛋白主要組分肽指紋圖譜。對南方水牛乳與不同來源的乳清蛋白的氨基酸序列研究結果表明，乳清蛋白經酶解后主要為α乳白蛋白（αLa）和β乳球蛋白（βLg）組分，乳清蛋白肽質指紋譜的分析顯示水牛乳與荷斯坦奶乳清蛋白αLa氨基酸發生變異的比率明顯少于山羊奶乳清蛋白αLa，說明荷斯坦奶αLa和水牛乳αLa的差異更小，同源性更強；而水牛乳βLg與荷斯坦乳βLg氨基酸發生變異的部位比率要多于山羊奶，水牛乳βLg與山羊奶同源性更強；乳源酪蛋白酶解后的肽段主要組分為αs1CN，βCN，κN，通過對水牛乳酪蛋白的氨基酸序列的差異性分析，不同品種的乳源酪蛋白的氨基酸序列明顯存在差異。與乳清蛋白相比，奶牛品種差異導致乳蛋白發生氨基酸差異現象更顯著，酪蛋白的氨基酸序列對比表明，水牛奶酪蛋白與山羊奶酪蛋白比與乳牛酪蛋白的差異更大。

關鍵詞：LTQ Orbitrap質譜； 乳源蛋白； 酪蛋白； 乳清蛋白； 肽質指紋譜； 差異性

1引言

動物乳中蛋白質主要由酪蛋白（αs1酪蛋白、αs2酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白） 、乳清蛋白（β乳球蛋白和 α乳白蛋白、免疫球蛋白、牛血清蛋白）組成，乳蛋白在體內合成過程中經過大量的遺傳變異和豐富的翻譯后修飾，并受到地域、品種、飼料、氣候諸多因素的影響，致使乳蛋白的合成及表達呈現出較大的差異[1]，乳蛋白的組成變得異常復雜。近年對乳及乳制品中蛋白質組分的分析檢測已有報道[2，3]，且主要集中在乳蛋白組分分離及含量檢測，但分析和鑒定復雜體系中的蛋白組分精細結構肽質指紋譜的差異性還是一大挑戰[4]。二維線性離子阱高分辨靜電場組合質譜儀（LTQ Orbitrap XL）具有非常高的靈敏度，能夠對樣品進行快速掃描，分辨率60 K時， 掃描周期不超過1 s； 具有高達100 K的分辨能力，可直接從復雜樣品中快速、靈敏、可靠地檢測化合物，在各個領域都有廣泛應用。本研究將利用LTQOrbitrap液相色譜質譜技術對南方水牛奶乳清蛋白的酶解肽段進行分析，檢測各離子片段的相對分子質量及氨基酸組成，使用Mascot軟件在數據庫中檢索，得出預測蛋白質的氨基酸序列，再與Pubmed數據庫中已知序列進行比對，得出蛋白源自種屬，并與乳牛奶酪蛋白和山羊奶酪蛋白相對應組分的氨基酸序列比對，研究其氨基酸序列間的差異，從而揭示由于乳牛品種遺傳特性差異引起乳清蛋白差異變化的本質規律，為不同條件下乳蛋白表達圖譜庫的建立及奶乳蛋白快速檢測尋找分子標記提供技術手段，為乳品加工保存條件的優選及乳源蛋白不同組分的生物活性肽的研究提供理論依據。

2實驗部分

2.1儀器、試劑與材料

LTQ Orbitrap XL質譜儀（Thermo公司）；反相高效液相色譜C18色譜柱（Michrom Bioresources公司）；超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物儀器公司）；SCIENTZ11D型高速冷凍離心機（Eppendorf公司）。

乙腈、NH4HCO3、三氟乙酸、二硫蘇糖醇、吲哚3乙酸等（Sigma公司）；胰蛋白酶（Promega公司）。南方水牛奶（購于廣州市某市場）。

2.2試劑的配制

2.3.2SDSPAGE電泳將分離得到的乳源蛋白SDSPAGE電泳，配制12%分離膠及5%濃縮膠，電泳完畢后用凝膠成像與分析系統對電泳圖進行光密度掃描，以等電點沉淀得到的水牛奶酪蛋白電泳圖作對比，初步確定分離出的蛋白成分和含量。

2.3.3蛋白膠內酶解將獲得的酪蛋白及乳清蛋白SDSPAGE膠分別按以下步驟酶解：切下SDSPAGE凝膠上的目標蛋白點分別于編號EP管中，水洗膠塊兩次，加入適量新鮮脫色劑，37 ℃水浴脫色至膠塊透明，棄液體；再用100% 乙腈脫水至膠塊變為白色，棄液體；加入5～6 mL 25 mmol/L NH4HCO3（含10 mmol/L DTT）還原劑并封口，57 ℃水浴1 h，取出樣品，冷卻至室溫，棄液體，迅速加入等體積的烷基化試劑，室溫避光放置30 min；去烷基化試劑，加入50%乙腈，靜置15 min；棄液體，加入5～6 mL 50 mmol/L NH4HCO3振蕩靜置吸脹5 min，棄液體；分別用50%和 100%乙腈脫水至膠塊變為白色，棄液體。分別加4 μL酶液于各EP管，冰上放置30 min后，吸走多余的酶液，加20 μL覆蓋液并封口，37 ℃保溫18 h。取樣品于10000 g/min條件下超聲5 min，上清液轉移至新的EP管中，膠塊中加入萃取液，37 ℃保溫30 min， 超聲后與之前上清液混合并真空冷凍干燥，備用。

2.3.4質譜分析取凍干的樣品，分別加入4 μL樣品溶解液，充分振蕩渦旋，于4 ℃下，13200 r/min離心15 min，取上清液進行質譜分析。樣品先經系統的反相高效液色譜C18柱（100 mm×100 μm， 3 μm）分離后，進入LTQ Orbitrap系統分析。樣品在反相柱上的洗脫梯度是5%～45%乙腈（含0.1% 甲酸）洗脫60 min，洗脫速度為30 nL/min。質譜參數：離子傳輸管溫度200 ℃；電噴霧電壓是1.85 kV。一級質譜Orbitrap掃描范圍是400～2000 Da，一級質譜里選取信號最強的10個母離子做二級質譜分析，動態排除功能開啟，時間90 s。二級質譜LTQ為CID碰撞模式，標準化碰撞能量35%，活化q值0.25，活化時間30 ms。肽段信息用Mascot軟件進行數據庫檢索，得出結果。

3結果與討論

3.1水牛奶乳清蛋白的總離子流色譜及二級質譜圖

蛋白酶酶解的水牛乳乳清蛋白、酪蛋白的多肽混合物經LTQOrbitrap XL液質聯用分析，獲得樣品的總離子流色譜圖（圖1）。水牛乳乳蛋白多肽混合物總離子流色譜圖縱坐標代表物質縱聲的總離子信號，總離子流色譜圖由許多峰組成，這些峰是按色譜峰出峰先后順序排列的，同一峰又由許多不同質荷比的碎片組成。同一個離子流峰中的不同的質荷比的碎片由小到大的順序形成質譜圖。

4結論

本實驗對乳源蛋白各個主要組分進行質譜分析，獲得水牛奶酪蛋白主要組分（αs1CN，βCN和κCN）和不同來源乳源乳蛋白主要組分（α乳白蛋白和β乳球蛋白）肽段的氨基酸序列信息，及各組分的完整氨基酸序列。結果表明，不同品種的乳源乳蛋白的氨基酸序列均不同，存在氨基酸變異現象。在α乳白蛋白的氨基酸序列對比中，水牛乳和羊奶的差異比荷斯坦奶的差異大；而在β乳球蛋白中， 水牛乳和荷斯坦奶的差異比羊奶的差異大。與酪蛋白相比，不同乳源兩種乳清蛋白的變異現象比酪蛋白少很多[7]； 與乳清蛋白相比，發生氨基酸差異現象的部位和比率更多； 在酪蛋白的氨基酸序列對比中， 水牛奶酪蛋白與山羊奶酪蛋白比與乳牛酪蛋白的差異更大。

References

1CHEN JingTing， MA Lu， YANG JinHui， ZHANG JuanXia， LI FaDi， BU DengPan. Chinese Journal of Animal Nutrition， 2013， 25（8）： 1683-1688

2FENG XuDong ，AN WeiDong， DING Yi ，YU AiMin， LIU Jing ，GAO DeJiang， WANG ZhiHong ，YU Yong. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（10）： 1496-1500

3Albreht A， Vovk I. J. Chromatogr. A， 2012， 1227：210-218

4Erve J C L， Gu M， Wang Y D， DeMaio W， Talaat R E. J. Am. Soc .Mass Spectrom.， 2009， 20： 2058-2069

5ZHANG Rui，YUAN MinWei，SHI BingZhao. Chinese J. Pharmaceuticals， 1999， 30（2）： 51-53

6LI YunKai， LI ZiChao， WANG LiNa， XU MingFang. Chinese J. Analysis Laboratory， 2011， 4（30）： 70-72

7CHENG XiFei， LI YunKai， XIANG MingXia， LI ZiChao， XU MingFang. Food Science and Technology， 2012， 11： 289-292

4結論

本實驗對乳源蛋白各個主要組分進行質譜分析，獲得水牛奶酪蛋白主要組分（αs1CN，βCN和κCN）和不同來源乳源乳蛋白主要組分（α乳白蛋白和β乳球蛋白）肽段的氨基酸序列信息，及各組分的完整氨基酸序列。結果表明，不同品種的乳源乳蛋白的氨基酸序列均不同，存在氨基酸變異現象。在α乳白蛋白的氨基酸序列對比中，水牛乳和羊奶的差異比荷斯坦奶的差異大；而在β乳球蛋白中， 水牛乳和荷斯坦奶的差異比羊奶的差異大。與酪蛋白相比，不同乳源兩種乳清蛋白的變異現象比酪蛋白少很多[7]； 與乳清蛋白相比，發生氨基酸差異現象的部位和比率更多； 在酪蛋白的氨基酸序列對比中， 水牛奶酪蛋白與山羊奶酪蛋白比與乳牛酪蛋白的差異更大。

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4Erve J C L， Gu M， Wang Y D， DeMaio W， Talaat R E. J. Am. Soc .Mass Spectrom.， 2009， 20： 2058-2069

5ZHANG Rui，YUAN MinWei，SHI BingZhao. Chinese J. Pharmaceuticals， 1999， 30（2）： 51-53

6LI YunKai， LI ZiChao， WANG LiNa， XU MingFang. Chinese J. Analysis Laboratory， 2011， 4（30）： 70-72

7CHENG XiFei， LI YunKai， XIANG MingXia， LI ZiChao， XU MingFang. Food Science and Technology， 2012， 11： 289-292

4結論

本實驗對乳源蛋白各個主要組分進行質譜分析，獲得水牛奶酪蛋白主要組分（αs1CN，βCN和κCN）和不同來源乳源乳蛋白主要組分（α乳白蛋白和β乳球蛋白）肽段的氨基酸序列信息，及各組分的完整氨基酸序列。結果表明，不同品種的乳源乳蛋白的氨基酸序列均不同，存在氨基酸變異現象。在α乳白蛋白的氨基酸序列對比中，水牛乳和羊奶的差異比荷斯坦奶的差異大；而在β乳球蛋白中， 水牛乳和荷斯坦奶的差異比羊奶的差異大。與酪蛋白相比，不同乳源兩種乳清蛋白的變異現象比酪蛋白少很多[7]； 與乳清蛋白相比，發生氨基酸差異現象的部位和比率更多； 在酪蛋白的氨基酸序列對比中， 水牛奶酪蛋白與山羊奶酪蛋白比與乳牛酪蛋白的差異更大。

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7CHENG XiFei， LI YunKai， XIANG MingXia， LI ZiChao， XU MingFang. Food Science and Technology， 2012， 11： 289-292