金屬螯合固相萃取整體柱的制備及其性能研究

趙書林等

摘要：基于金屬螯合物中Cu2+與氨基硫醇類化合物（如半胱氨酸的SH基團）之間的親和作用，設計合成了一種金屬螯合整體柱，并用作固相萃取吸附劑。實驗以亞氨基二乙酸（IDA）三齒配體為中間介質，通過化學修飾法鍵合在聚（甲基丙烯酸縮水甘油酯乙二醇二甲基丙烯酸酯）（poly（GMAcoEDMA））整體柱孔表面，再利用配位結合作用螯合Cu2+，合成 poly（GMAcoEDMAIDA Cu2+） 整體柱。實驗以谷胱甘肽為探針測試化合物，考察了該整體柱固定相的萃取性能，并優化了實驗條件。在最佳實驗條件下，此整體柱對谷胱甘肽的吸附容量為43.15 mg/g，并能有效富集人血漿樣品中的氨基硫醇類化合物。

關鍵詞：金屬螯合物； 聚合物整體柱； 固相萃取； 氨基硫醇

1引言

近年來，在生物樣品預處理領域中，整體柱得到了快速發展[1]。整體柱的比表面積大，可以使萃取介質的體積大大增加，從而提高萃取容量；而且整體柱的制備比較簡單，生物相容性好；使用整體柱作萃取柱，其特有的穿透孔為液體的流動提供了大孔通道，明顯減小傳質阻力，提高萃取效率；此外，在萃取過程中，聚合物整體柱具有很好的重復性， 在較寬的pH范圍內具有極高的穩定性[2～4]。Zhang等[5]通過戊二醛法將酶固定于聚（丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺）整體柱上制備固定酶微反應器，并用于消解牛血清白蛋白（BSA）。Sinz課題組[6]過戊二醛法分別在聚（甲基丙烯酸縮水甘油酯丙烯酰胺二甲基丙烯酸酯）柱和聚（甲基丙烯酸縮水甘油酯二甲基丙烯酸酯）柱 （poly（GMAcoEDMA）） 表面修飾上單體抗生物素蛋白，用于捕獲乙二醇BSA。

過渡金屬離子易與螯合劑中的N， O和S原子以配位鍵形式連接，形成金屬螯合物。這些金屬螯合物與位于蛋白質表面組氨酸的咪唑基、氨基硫醇（如半胱氨酸）的巰基，以及色氨酸的吲哚基發生親和作用。目前，金屬螯合親和色譜已經成功應用于蛋白質以及多肽的工業生產。Ma等[7]在二氧化硅磁納米粒子上修飾亞氨基二乙酸（IDA），通入Cu2+制備金屬銅螯合物，用于富集BSA。Ensinger研究組[8]在表面含有羧基的納米孔內固定帶有氨基的三聯吡啶（terPy），通入Fe2+制得Fe2+terPy螯合物，并用作生物傳感器，識別生物分子如乳鐵蛋白。此外，這類材料還可以處理肽類物質及某些藥物。Wang等[9]合成了聚甲基丙烯酸甲酯二乙烯基苯（poly（MAcoDVB）） 磁性微球，并以IDA三齒配體作為中間介質，螯合Cu2+制備了poly（MAcoDVB）IDACu磁性微球螯合物，用作富集谷胱甘肽。Gu等[10]以IDA作有機配體，合成了Cu和Fe金屬螯合物，用于富集含糖肽的博來霉素抗癌藥物。

本研究結合金屬螯合物和有機聚合物整體柱的優點，設計合成一種金屬螯合親和整體柱，用于固相萃取吸附劑。利用IDA 三齒配體為中間介質，將其鍵合在 poly（GMAcoEDMA） 聚合物基質整體柱表面，再螯合 Cu2+，制得毛細管固相萃取整體柱。以谷胱甘肽等含有巰基的氨基硫醇類化合物為分析測試物，詳細考察此整體柱的萃取性能。

2實驗部分

2.1試劑與儀器

2.2制備金屬螯合整體柱

3.3氨基硫醇類化合物的預分離富集

將GSH， Cys和HCys 3種混合物標準溶液經poly（GMAcoEDMAIDACu2+）整體柱和poly（GMAcoEDMA） 基質整體柱預處理后進行電泳分析，如圖9所示。從圖9可見， poly（GMAcoEDMAIDACu2+）整體柱對3種含巰基的氨基硫醇化合物具有明顯的富集作用。

實驗還以加標人血漿樣品為分析測試物，考察poly（GMAcoEDMAIDACu2+）整體柱對復雜樣品中氨基硫醇類化合物的富集性能。圖10a 是加標GSH、Cys和HCys標準溶液的血漿樣品的電泳分析圖，血漿樣品的復雜基質嚴重干擾了GSH， Cys和HCys 這3種物質的分離檢測。圖10c 是將poly（GMAcoEDMA） 作為固相萃取整體柱對血漿樣品進行預處理后的電泳圖，可見它并不能有效地去除基質的干擾。加標血漿樣品經poly（GMAcoEDMAIDACu2+） 整體柱預處理之后，成功檢測到了GSH， Cys和HCys這3種物質，避免了復雜血漿樣品的基質干擾（圖10b）。

4結論

本研究基于金屬螯合物中Cu2+與氨基硫醇如半胱氨酸的SH功能團間的親和作用，在大孔徑的毛細管內合成了 poly（GMAcoEDMAIDACu2+） 整體柱，用作固相萃取吸附劑。實驗以GSH、Cys和HCys作為分析測試化合物，考察了其萃取性能。結果表明，此整體柱對巰基化合物具有較好的選擇性，較大的吸附容量且可重復使用。此外，該固相萃取整體柱的制備方法簡單，預處理過程簡便、快速，有望應用于實際樣品中巰基化合物的預分離富集。

References

1Namera A， Saito T. TrACTrends Anal. Chem.， 2013， 45： 182-196

2DING MingYu， ZHENG Rui， PENG Hong. Chinese J. Anal. Chem.， 2009， 37（3）： 395-398

3Fan Y， Feng Y， Zhang J. Da S， Zhang M. J. Chromatogr. A， 2005， 1074（12）： 9-16

4Potter O G， Hilder E F. J. Sep. Sci.， 2008， 31（11）： 1881-1906

5Wu S， Sun L， Ma J， Yang K， Liang Z， Zhang L， Zhang Y. Talanta， 2011， 83（5）： 1748-1753

6Spro J， Sinz A. Anal. Bioanal. Chem.， 2012， 402（7）： 2395-2405

7Ma Z， Guan Y， Liu H. J. Magn. Magn. Mater.， 2006， 301（2）： 469-477

8Ali M， Nasir S， Nguyen Q H， Sahoo J K， Tahir M N， Tremel W， Ensinger W. J. Am. Chem. Soc.， 2011， 133（43）： 17307-17314

9Wang Q， Guan Y， Yang M. J. Magn. Magn. Mater.， 2012， 324（20）： 3300-3305

10Gu J， Codd R. J. Inorg. Biochem.， 2012， 115： 198-203

11YE FangGui， HAN YanYan， WANG Shun， HUANG BaoJun， ZHAO ShuLin. Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（2）： 192-196

12ZHANG AiZhu， YE FangGui， LU JunYu， WEI Zong， PENG Yan， ZHAO ShuLin. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（8）： 1247-1250

13Zhang M， Wei F， Zhang Y， Nie J， Feng Y. J. Chromatogr. A， 2006， 1102（12）： 294-301

摘要：基于金屬螯合物中Cu2+與氨基硫醇類化合物（如半胱氨酸的SH基團）之間的親和作用，設計合成了一種金屬螯合整體柱，并用作固相萃取吸附劑。實驗以亞氨基二乙酸（IDA）三齒配體為中間介質，通過化學修飾法鍵合在聚（甲基丙烯酸縮水甘油酯乙二醇二甲基丙烯酸酯）（poly（GMAcoEDMA））整體柱孔表面，再利用配位結合作用螯合Cu2+，合成 poly（GMAcoEDMAIDA Cu2+） 整體柱。實驗以谷胱甘肽為探針測試化合物，考察了該整體柱固定相的萃取性能，并優化了實驗條件。在最佳實驗條件下，此整體柱對谷胱甘肽的吸附容量為43.15 mg/g，并能有效富集人血漿樣品中的氨基硫醇類化合物。

關鍵詞：金屬螯合物； 聚合物整體柱； 固相萃取； 氨基硫醇

1引言

近年來，在生物樣品預處理領域中，整體柱得到了快速發展[1]。整體柱的比表面積大，可以使萃取介質的體積大大增加，從而提高萃取容量；而且整體柱的制備比較簡單，生物相容性好；使用整體柱作萃取柱，其特有的穿透孔為液體的流動提供了大孔通道，明顯減小傳質阻力，提高萃取效率；此外，在萃取過程中，聚合物整體柱具有很好的重復性， 在較寬的pH范圍內具有極高的穩定性[2～4]。Zhang等[5]通過戊二醛法將酶固定于聚（丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺）整體柱上制備固定酶微反應器，并用于消解牛血清白蛋白（BSA）。Sinz課題組[6]過戊二醛法分別在聚（甲基丙烯酸縮水甘油酯丙烯酰胺二甲基丙烯酸酯）柱和聚（甲基丙烯酸縮水甘油酯二甲基丙烯酸酯）柱 （poly（GMAcoEDMA）） 表面修飾上單體抗生物素蛋白，用于捕獲乙二醇BSA。

過渡金屬離子易與螯合劑中的N， O和S原子以配位鍵形式連接，形成金屬螯合物。這些金屬螯合物與位于蛋白質表面組氨酸的咪唑基、氨基硫醇（如半胱氨酸）的巰基，以及色氨酸的吲哚基發生親和作用。目前，金屬螯合親和色譜已經成功應用于蛋白質以及多肽的工業生產。Ma等[7]在二氧化硅磁納米粒子上修飾亞氨基二乙酸（IDA），通入Cu2+制備金屬銅螯合物，用于富集BSA。Ensinger研究組[8]在表面含有羧基的納米孔內固定帶有氨基的三聯吡啶（terPy），通入Fe2+制得Fe2+terPy螯合物，并用作生物傳感器，識別生物分子如乳鐵蛋白。此外，這類材料還可以處理肽類物質及某些藥物。Wang等[9]合成了聚甲基丙烯酸甲酯二乙烯基苯（poly（MAcoDVB）） 磁性微球，并以IDA三齒配體作為中間介質，螯合Cu2+制備了poly（MAcoDVB）IDACu磁性微球螯合物，用作富集谷胱甘肽。Gu等[10]以IDA作有機配體，合成了Cu和Fe金屬螯合物，用于富集含糖肽的博來霉素抗癌藥物。

本研究結合金屬螯合物和有機聚合物整體柱的優點，設計合成一種金屬螯合親和整體柱，用于固相萃取吸附劑。利用IDA 三齒配體為中間介質，將其鍵合在 poly（GMAcoEDMA） 聚合物基質整體柱表面，再螯合 Cu2+，制得毛細管固相萃取整體柱。以谷胱甘肽等含有巰基的氨基硫醇類化合物為分析測試物，詳細考察此整體柱的萃取性能。

2實驗部分

2.1試劑與儀器

2.2制備金屬螯合整體柱

3.3氨基硫醇類化合物的預分離富集

將GSH， Cys和HCys 3種混合物標準溶液經poly（GMAcoEDMAIDACu2+）整體柱和poly（GMAcoEDMA） 基質整體柱預處理后進行電泳分析，如圖9所示。從圖9可見， poly（GMAcoEDMAIDACu2+）整體柱對3種含巰基的氨基硫醇化合物具有明顯的富集作用。

實驗還以加標人血漿樣品為分析測試物，考察poly（GMAcoEDMAIDACu2+）整體柱對復雜樣品中氨基硫醇類化合物的富集性能。圖10a 是加標GSH、Cys和HCys標準溶液的血漿樣品的電泳分析圖，血漿樣品的復雜基質嚴重干擾了GSH， Cys和HCys 這3種物質的分離檢測。圖10c 是將poly（GMAcoEDMA） 作為固相萃取整體柱對血漿樣品進行預處理后的電泳圖，可見它并不能有效地去除基質的干擾。加標血漿樣品經poly（GMAcoEDMAIDACu2+） 整體柱預處理之后，成功檢測到了GSH， Cys和HCys這3種物質，避免了復雜血漿樣品的基質干擾（圖10b）。

4結論

本研究基于金屬螯合物中Cu2+與氨基硫醇如半胱氨酸的SH功能團間的親和作用，在大孔徑的毛細管內合成了 poly（GMAcoEDMAIDACu2+） 整體柱，用作固相萃取吸附劑。實驗以GSH、Cys和HCys作為分析測試化合物，考察了其萃取性能。結果表明，此整體柱對巰基化合物具有較好的選擇性，較大的吸附容量且可重復使用。此外，該固相萃取整體柱的制備方法簡單，預處理過程簡便、快速，有望應用于實際樣品中巰基化合物的預分離富集。

References

1Namera A， Saito T. TrACTrends Anal. Chem.， 2013， 45： 182-196

2DING MingYu， ZHENG Rui， PENG Hong. Chinese J. Anal. Chem.， 2009， 37（3）： 395-398

3Fan Y， Feng Y， Zhang J. Da S， Zhang M. J. Chromatogr. A， 2005， 1074（12）： 9-16

4Potter O G， Hilder E F. J. Sep. Sci.， 2008， 31（11）： 1881-1906

5Wu S， Sun L， Ma J， Yang K， Liang Z， Zhang L， Zhang Y. Talanta， 2011， 83（5）： 1748-1753

6Spro J， Sinz A. Anal. Bioanal. Chem.， 2012， 402（7）： 2395-2405

7Ma Z， Guan Y， Liu H. J. Magn. Magn. Mater.， 2006， 301（2）： 469-477

8Ali M， Nasir S， Nguyen Q H， Sahoo J K， Tahir M N， Tremel W， Ensinger W. J. Am. Chem. Soc.， 2011， 133（43）： 17307-17314

9Wang Q， Guan Y， Yang M. J. Magn. Magn. Mater.， 2012， 324（20）： 3300-3305

10Gu J， Codd R. J. Inorg. Biochem.， 2012， 115： 198-203

11YE FangGui， HAN YanYan， WANG Shun， HUANG BaoJun， ZHAO ShuLin. Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（2）： 192-196

12ZHANG AiZhu， YE FangGui， LU JunYu， WEI Zong， PENG Yan， ZHAO ShuLin. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（8）： 1247-1250

13Zhang M， Wei F， Zhang Y， Nie J， Feng Y. J. Chromatogr. A， 2006， 1102（12）： 294-301

摘要：基于金屬螯合物中Cu2+與氨基硫醇類化合物（如半胱氨酸的SH基團）之間的親和作用，設計合成了一種金屬螯合整體柱，并用作固相萃取吸附劑。實驗以亞氨基二乙酸（IDA）三齒配體為中間介質，通過化學修飾法鍵合在聚（甲基丙烯酸縮水甘油酯乙二醇二甲基丙烯酸酯）（poly（GMAcoEDMA））整體柱孔表面，再利用配位結合作用螯合Cu2+，合成 poly（GMAcoEDMAIDA Cu2+） 整體柱。實驗以谷胱甘肽為探針測試化合物，考察了該整體柱固定相的萃取性能，并優化了實驗條件。在最佳實驗條件下，此整體柱對谷胱甘肽的吸附容量為43.15 mg/g，并能有效富集人血漿樣品中的氨基硫醇類化合物。

關鍵詞：金屬螯合物； 聚合物整體柱； 固相萃取； 氨基硫醇

1引言

近年來，在生物樣品預處理領域中，整體柱得到了快速發展[1]。整體柱的比表面積大，可以使萃取介質的體積大大增加，從而提高萃取容量；而且整體柱的制備比較簡單，生物相容性好；使用整體柱作萃取柱，其特有的穿透孔為液體的流動提供了大孔通道，明顯減小傳質阻力，提高萃取效率；此外，在萃取過程中，聚合物整體柱具有很好的重復性， 在較寬的pH范圍內具有極高的穩定性[2～4]。Zhang等[5]通過戊二醛法將酶固定于聚（丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺）整體柱上制備固定酶微反應器，并用于消解牛血清白蛋白（BSA）。Sinz課題組[6]過戊二醛法分別在聚（甲基丙烯酸縮水甘油酯丙烯酰胺二甲基丙烯酸酯）柱和聚（甲基丙烯酸縮水甘油酯二甲基丙烯酸酯）柱 （poly（GMAcoEDMA）） 表面修飾上單體抗生物素蛋白，用于捕獲乙二醇BSA。

過渡金屬離子易與螯合劑中的N， O和S原子以配位鍵形式連接，形成金屬螯合物。這些金屬螯合物與位于蛋白質表面組氨酸的咪唑基、氨基硫醇（如半胱氨酸）的巰基，以及色氨酸的吲哚基發生親和作用。目前，金屬螯合親和色譜已經成功應用于蛋白質以及多肽的工業生產。Ma等[7]在二氧化硅磁納米粒子上修飾亞氨基二乙酸（IDA），通入Cu2+制備金屬銅螯合物，用于富集BSA。Ensinger研究組[8]在表面含有羧基的納米孔內固定帶有氨基的三聯吡啶（terPy），通入Fe2+制得Fe2+terPy螯合物，并用作生物傳感器，識別生物分子如乳鐵蛋白。此外，這類材料還可以處理肽類物質及某些藥物。Wang等[9]合成了聚甲基丙烯酸甲酯二乙烯基苯（poly（MAcoDVB）） 磁性微球，并以IDA三齒配體作為中間介質，螯合Cu2+制備了poly（MAcoDVB）IDACu磁性微球螯合物，用作富集谷胱甘肽。Gu等[10]以IDA作有機配體，合成了Cu和Fe金屬螯合物，用于富集含糖肽的博來霉素抗癌藥物。

本研究結合金屬螯合物和有機聚合物整體柱的優點，設計合成一種金屬螯合親和整體柱，用于固相萃取吸附劑。利用IDA 三齒配體為中間介質，將其鍵合在 poly（GMAcoEDMA） 聚合物基質整體柱表面，再螯合 Cu2+，制得毛細管固相萃取整體柱。以谷胱甘肽等含有巰基的氨基硫醇類化合物為分析測試物，詳細考察此整體柱的萃取性能。

2實驗部分

2.1試劑與儀器

2.2制備金屬螯合整體柱

3.3氨基硫醇類化合物的預分離富集

將GSH， Cys和HCys 3種混合物標準溶液經poly（GMAcoEDMAIDACu2+）整體柱和poly（GMAcoEDMA） 基質整體柱預處理后進行電泳分析，如圖9所示。從圖9可見， poly（GMAcoEDMAIDACu2+）整體柱對3種含巰基的氨基硫醇化合物具有明顯的富集作用。

實驗還以加標人血漿樣品為分析測試物，考察poly（GMAcoEDMAIDACu2+）整體柱對復雜樣品中氨基硫醇類化合物的富集性能。圖10a 是加標GSH、Cys和HCys標準溶液的血漿樣品的電泳分析圖，血漿樣品的復雜基質嚴重干擾了GSH， Cys和HCys 這3種物質的分離檢測。圖10c 是將poly（GMAcoEDMA） 作為固相萃取整體柱對血漿樣品進行預處理后的電泳圖，可見它并不能有效地去除基質的干擾。加標血漿樣品經poly（GMAcoEDMAIDACu2+） 整體柱預處理之后，成功檢測到了GSH， Cys和HCys這3種物質，避免了復雜血漿樣品的基質干擾（圖10b）。

4結論

本研究基于金屬螯合物中Cu2+與氨基硫醇如半胱氨酸的SH功能團間的親和作用，在大孔徑的毛細管內合成了 poly（GMAcoEDMAIDACu2+） 整體柱，用作固相萃取吸附劑。實驗以GSH、Cys和HCys作為分析測試化合物，考察了其萃取性能。結果表明，此整體柱對巰基化合物具有較好的選擇性，較大的吸附容量且可重復使用。此外，該固相萃取整體柱的制備方法簡單，預處理過程簡便、快速，有望應用于實際樣品中巰基化合物的預分離富集。

References

1Namera A， Saito T. TrACTrends Anal. Chem.， 2013， 45： 182-196

2DING MingYu， ZHENG Rui， PENG Hong. Chinese J. Anal. Chem.， 2009， 37（3）： 395-398

3Fan Y， Feng Y， Zhang J. Da S， Zhang M. J. Chromatogr. A， 2005， 1074（12）： 9-16

4Potter O G， Hilder E F. J. Sep. Sci.， 2008， 31（11）： 1881-1906

5Wu S， Sun L， Ma J， Yang K， Liang Z， Zhang L， Zhang Y. Talanta， 2011， 83（5）： 1748-1753

6Spro J， Sinz A. Anal. Bioanal. Chem.， 2012， 402（7）： 2395-2405

7Ma Z， Guan Y， Liu H. J. Magn. Magn. Mater.， 2006， 301（2）： 469-477

8Ali M， Nasir S， Nguyen Q H， Sahoo J K， Tahir M N， Tremel W， Ensinger W. J. Am. Chem. Soc.， 2011， 133（43）： 17307-17314

9Wang Q， Guan Y， Yang M. J. Magn. Magn. Mater.， 2012， 324（20）： 3300-3305

10Gu J， Codd R. J. Inorg. Biochem.， 2012， 115： 198-203

11YE FangGui， HAN YanYan， WANG Shun， HUANG BaoJun， ZHAO ShuLin. Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（2）： 192-196

12ZHANG AiZhu， YE FangGui， LU JunYu， WEI Zong， PENG Yan， ZHAO ShuLin. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（8）： 1247-1250

13Zhang M， Wei F， Zhang Y， Nie J， Feng Y. J. Chromatogr. A， 2006， 1102（12）： 294-301