利用模擬酶催化顯色和等溫核酸擴增反應檢測特定序列DNA

湯薇等

摘要：基于血紅素（Hemin）與G四聯體（G4）所形成模擬酶的催化作用，結合等溫指數擴增反應（IEXPAR），建立了特定序列DNA的顯色檢測方法。目標DNA引發IEXPAR，通過設計模板序列，IEXPAR產生大量富含鳥嘌呤的單鏈DNA，在K+存在時，該單鏈DNA可形成G4結構，G4可以與Hemin結合形成具有過氧化物酶活性的模擬酶（HeminG4），HeminG4催化H2O2氧化2，2聯氮二（3乙基苯并噻唑6磺酸）二銨鹽 （ABTS），使體系顏色發生變化，反應產物最大吸收波長為421 nm。對顯色反應體系中的實驗參數進行了優化，包括Hemin濃度、ABTS濃度、H2O2濃度、IEXPAR時間和顯色反應時間。在最佳條件下，所建立的體系可以簡便、快速檢測0.1～10 nmol/L的目標DNA分子，且本方法能夠很好地區分單個堿基的差別，具有良好的特異性。

關鍵詞：特定序列DNA的檢測； 等溫指數擴增（IEXPAR）； HeminG4模擬酶； 顯色分析

1引言

核酸擴增是實現高靈敏度檢測核酸的重要手段。目前常用的核酸擴增技術是聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction， PCR），但PCR需要精確的熱循環和嚴格的反應條件。近年來，核酸的等溫擴增技術得到了迅速發展[1]。等溫指數擴增反應（Isothermal exponential amplification reaction，IEXPAR）是Galas等建立的一種新型的核酸擴增技術[2]。結合DNA聚合酶催化的延伸反應及切刻內切酶的剪切作用，IEXPAR可以在等溫條件下，短時間內對目標核酸分子擴增106～109倍。該技術具有簡便、快速的顯著優點，其擴增倍數可與PCR媲美。目前IEXPAR已廣泛用于特定序列DNA分析[3]、病毒基因鑒定[4，5]、microRNA測定[6，7]以及轉錄因子分析[8]。但基于IEXPAR的核酸分析多采用實時熒光檢測方法，需要昂貴的實時熒光定量PCR等儀器。

在K+存在時，富含鳥嘌呤的單鏈DNA（G4DNA）通過分子內氫鍵的相互作用可折疊形成穩定的G四聯體結構（G4）[9～11]，G4可與氯高鐵血紅素（Hemin）結合，形成具有過氧化物酶活性的模擬酶（HeminG4）[12]，HeminG4可以催化H2O2與2，2聯氮二（3乙基苯并噻唑6磺酸）二銨鹽（ABTS）的氧化反應，使體系顏色發生變化，并在421 nm產生最大吸收。本研究通過設計IEXPAR反應模板，產生G4DNA，利用HeminG4模擬酶的催化作用，結合等溫指數擴增反應，建立了一種廉價、簡便的顯色法檢測特定序列DNA的新方法。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

3結果與討論

3.1等溫指數擴增及顯色法檢測DNA的原理

等溫指數擴增及顯色法檢測DNA的原理如圖1所示，首先根據檢測的TargetDNA及G4DNA 的序列設計擴增模板Template 1和Template 2。Template 1的3′端序列與TargetDNA序列互補，5′端序列與G4DNA序列互補，Template 2的3′端和5′端序列相同且與G4DNA完全互補。Template 1和Template 2中間都含有切刻內切酶Nt.BstNBI特異性識別序列；在DNA聚合酶和dNTPs存在時，TargetDNA與Template 1的3′端序列雜交， 并進行延伸反應， 形成含有Nt.BstNBI特異性識別序列的雙鏈DNA，Nt.BstNBI將識別對應的雙鏈序列，并從其后4個堿基處將DNA剪切，釋放出G4DNA；切口處的DNA繼續延伸并被剪切，釋放出更多的G4DNA，形成線性放大的機制。另外，釋放出的G4DNA與Template 2的3′端序列雜交，并在聚合酶作用下沿著Template 2延伸形成雙鏈DNA，Nt.BstNBI識別其特異性序列并將延伸反應產生的DNA剪切，切口處DNA繼續延伸、被剪切，這樣不斷進行剪切延伸剪切，形成指數擴增機制，產生大量G4DNA。在K+存在時，G4DNA形成G4結構，G4與Hemin結合形成具有過氧化物酶活性的模擬酶，該模擬酶可以催化ABTSH2O2體系發生氧化還原反應， 并伴隨顏色變化， 反應產物最大吸收波長為421 nm。通過測定吸光度可靈敏地檢測TargetDNA。

3.2實驗條件優化

3.2.1Hemin濃度優化固定ABTS濃度為5.0 mmol/L，H2O2濃度為1.0 mmol/L，G4DNA為1 μmol/L，研究了不同濃度Hemin與G4DNA所形成的模擬酶對ABTSH2O2顯色體系吸光度的影響，結果如圖2所示。當Hemin濃度低于2.5 μmol/L時，體系的吸光度隨著Hemin濃度升高快速增加；當Hemin濃度大于2.5 μmol/L時，吸光度隨著Hemin濃度增加的趨勢趨于平緩。同時，空白的吸光度隨著Hemin濃度升高逐漸增加。當Hemin濃度等于2.5 μmol/L，G4DNA產生的吸光度與空白的差值達到最大值。本實驗測定DNA時， Hemin濃度選擇為2.5 μmol/L。

3.2.2ABTS濃度優化選擇Hemin濃度為2.5 μmol/L，H2O2濃度為1.0 mmol/L，G4DNA為1 μmol/L，考察了ABTS濃度對模擬酶ABTSH2O2顯色體系吸光度的影響。由圖3可見，隨著ABTS濃度增大，G4DNA所產生的吸光度呈逐漸增長趨勢； ABTS濃度高于5 mmol/L， 吸光度增加趨于平緩，同時，由于ABTS在421 nm產生微弱的吸收，空白吸光度也隨ABTS濃度的升高逐漸增加。綜合考慮，本實驗中ABTS最佳濃度選擇5 mmol/L。

3.4檢測方法的特異性評價

為了評價所建立方法對檢測特定序列的TargetDNA的特異性，按照2.2.1節的方法，在相同條件下對10 pmol/L TargetDNA及分別含有1， 2和 3個突變堿基的Mutant DNA 1， Mutant DNA 2和Mutant DNA 3（序列見表1）同時進行測定，結果表明，Mutant DNA 1， Mutant DNA 2和Mutant DNA 3對檢測10 pmol/L TargetDNA產生的干擾分別為6.3%， 1.3%和0.1%。表明本方法能夠很好地識別TargetDNA中單個堿基差別，對特定序列的TargetDNA測定具有良好的特異性。

4結論

建立了一種利用顯色法結合IEXPAR高靈敏、高特異性檢測DNA的新方法。利用雙擴增模板模型，通過設計Template 1的3′端序列實現不同特定序列核酸（包括DNA和RNA）的分析檢測，同時Template 1的5′端序列和Template 2可以作為普遍適用的序列實現IEXPAR的顯色檢測；利用HeminG4模擬酶催化ABTSH2O2顯色反應，只需簡單的分光光度計進行檢測，降低了檢測的成本；本方法可以利用微孔板檢測系統（如酶標儀）， 實現高通量的樣品分析。

References

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