油脂類食品中脂肪酸單氯丙醇單酯和雙酯的分離測定

2014-10-24 21:15:14傅武勝等

分析化學 2014年4期

傅武勝等

摘要：建立了食品中脂肪酸單氯丙醇單酯與雙酯含量的測定方法。稱取0.1 g的油脂樣品，加入內標后，轉入氨基固相萃取柱，先以6.0 mL正己烷洗脫脂肪酸單氯丙醇雙酯（MCPD雙酯），再以6.0 mL正己烷-乙酸乙酯混合溶劑洗脫脂肪酸單氯丙醇單酯（MCPD單酯），分別收集洗脫液并濃縮至近干，殘余物經甲醇鈉水解和苯基硼酸（PBA）衍生后，供氣相色譜/質譜（GCMS）分析。MCPD單酯、MCPD雙酯的檢出限在83～142 μg/kg（均以MCPD計）之間，線性范圍為25～500 μg/L（R2>0.9990）。以花生油和嬰幼兒奶粉脂肪提取物為基質，在250～1000 μg/kg范圍內進行3種濃度水平的加標回收實驗，MCPD單酯與雙酯的回收率在86.5%～104.0%之間，相對標準偏差（RSD）為2.4%～13.2%（n=6）。此外，本方法成功應用于市售食用植物油和嬰幼兒奶粉中MCPD單、雙酯的污染調查。

關鍵詞：脂肪酸； 3氯1，2丙二醇單酯； 3氯1，2丙二醇雙酯； 2氯1，3丙二醇單酯； 2氯1，3丙二醇雙酯；食用植物油；奶粉；氣相色譜質譜法；固相萃取法

1引言

氯丙醇與脂肪酸酯化形成的脂肪酸氯丙醇酯（氯丙酯）是近年來國際上新出現的食品安全問題，尤其是脂肪酸3氯1，2丙二醇酯（簡稱3MCPD酯）的污染最為突出。氯丙醇是公認的食品加工中形成的污染物，3氯1，2丙二醇（3MCPD）具有腎臟毒性、生殖毒性、免疫抑制作用和潛在致癌性而被廣泛關注[1，2]。早在1980年就發現植物蛋白在酸水解中會形成3MCPD酯[3，4]，隨后在奶粉[5]、山羊奶[6]、食用油[7]以及油炸食品[8]中也檢出該成分。氯丙酯尤其在食用油和奶粉等脂肪含量較高的食品中污染水平較高，食物中氯丙酯的含量是氯丙醇的5～396倍[9～13]，因此氯丙酯問題引起了歐盟等食品安全機構的極大關注。目前，氯丙酯的毒性仍不清楚，對其健康風險的擔心主要是因為氯丙酯的水解產物氯丙醇的毒性作用[14～17]。3MCPD酯在腸道水解后將增加人體3MCPD的暴露水平，3MCPD攝入量是其暫定每日最大耐受量（TDI）（2 μg/kg·bw）的5～100倍[18，19]。由于3MCPD具有1～2個羥基，因此3MCPD酯具有3MCPD單酯和雙酯兩種形式，結構上的差異可能導致毒理學作用的差異。實驗表明，3MCPD雙酯會致大鼠精子減少（生殖毒性），3MCPD單酯不僅具有生殖毒性，還可能造成大鼠腎小管壞死（腎臟毒性）[16]。在模擬腸道的脂肪酶水解試驗中發現，3MCPD單酯水解生成3MCPD的速率遠超過3MCPD雙酯[20，21]。因此，有必要對3MCPD單/雙酯進行分離和分別檢測，獲得食品中3MCPD單酯與雙酯含量的數據，以更準確地評估3MCPD酯的健康風險。

國際上測定食品（油脂）中3MCPD酯總量的研究較多[22]，但對3MCPD單/雙酯含量分別檢測的研究極少。據報道采用氨丙基（Aminopropyl）[23]或硅膠[24]固相萃取法，以正己烷、乙醚、二氯甲烷、石油醚和乙酸乙酯混合溶劑洗脫，將3MCPD單酯與雙酯分離，進一步水解、凈化、衍生后，用GCMS分別檢測。但該法所用溶劑種類多、比例復雜、體積多達850 mL、操作較為繁瑣，且未證實方法是否適合各類油脂中不同脂肪酸組成的氯丙醇單酯、雙酯。超臨界流體色譜三重四級桿串聯質譜法也可用于測定3MCPD單酯/雙酯[25]，該法測定步驟雖簡單，但對儀器要求較高，且容易污染。本研究采用氨基固相萃取法，利用正己烷-乙酸乙酯混合溶劑洗脫，并采用堿水解苯基硼酸（PBA）衍生GCMS法測定[26]；方法除了可測定3MCPD單酯/雙酯外，還可能適用于2氯1，3丙二醇（2MCPD）單酯/雙酯的測定。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

3800型氣相色譜儀和Saturn 2200離子阱型質譜儀（美國Varian公司）；NEVAPTM 111型氮吹儀（美國Organomation Associates公司）；Microfuge型高速離心機（美國Beckman公司）；6 mL聚丙烯固相萃取柱柱筒（Angela公司）。玻璃器皿在220 ℃下烘烤3 h后使用。

2.4標準曲線的建立

準確移取適量標準及內標工作液，以正己烷稀釋成濃度分別為25， 50， 100， 200和500 μg/L的MCPD單酯、MCPD雙酯標準系列，內標濃度均為100 μg/L，再按文獻[21]方法水解、凈化、衍生處理，供GCMS分析。

2.5樣品中氯丙酯含量的測定

上樣：稱取0.1 g食用油或油脂食品的脂肪于1.5 mL塑料離心管中，準確加入混合內標工作液50 μL，渦旋混勻后超聲5 min，轉入固相萃取柱（500 mg/6 mL，經4.0 mL正己烷活化），并以0.2 mL正己烷洗滌離心管兩次，將洗滌液一并轉入固相萃取柱中。

洗脫：先以6 mL正己烷洗脫MCPD雙酯；再用正己烷/乙酸乙酯（7∶3， V/V）洗脫MCPD單酯，分別收集洗脫液，并將洗脫液置于氮氣流下緩緩濃縮至近干。

分別于上述分離得到的樣品中，超聲混勻，再按文獻 [26]方法水解、凈化、衍生處理，得到1.0 mL待測溶液，供GCMS分析，以同位素內標法定量。

3結果與討論

3.1MCPD衍生物的鑒定以及定量離子的確定

3.3洗脫分離溶劑的比例

分別以10 mL不同比例的正己烷乙酸乙酯（9∶1， 8∶2， 7∶3， V/V）和正己烷作為洗脫劑，每種條件重復3次。對于MCPD雙酯，4種溶劑皆能將其洗脫下來，但以10 mL正己烷的洗脫效果最優，回收率為83.1%～103.0%；對于MCPD單酯，除10 mL正己烷外，其余3種比例的溶劑均能將其洗脫下來，并以正己烷乙酸乙酯（7∶3， V/V）洗脫效果最好，回收率在87.2%～97.8%之間。這可能由于MCPD單酯與雙酯結構上有差異，導致兩者極性不同，含有一個羥基的MCPD單酯極性略強于MCPD雙酯。因此，采用正己烷作為MCPD雙酯的洗脫溶劑，正己烷乙酸乙酯（7∶3， V/V）作為MCPD單酯的洗脫溶劑。

3.4洗脫分離溶劑的體積

為進一步確定所需的洗脫劑體積，分別以10 mL正己烷、正己烷/乙酸乙酯（7∶3， V/V）洗脫MCPD雙酯與MCPD單酯，每2 mL為一階段收集洗脫液。結果表明，無論是MCPD單酯還是MCPD雙酯，當洗脫溶劑體積為4.0 mL時，其回收率較為理想（94.6%～99.3%）；增至6.0 mL時，結果與4.0 mL相差不大，說明4.0 mL溶劑足以洗脫大部分的MCPD單酯/雙酯。但考慮到實驗條件可能存在的微小變化，如填料的松緊或者洗脫流速的差異等，甚至某些樣品MCPD單/雙酯含量異常高，因此洗脫溶劑體積均選擇6.0 mL。

3.5不同類型脂肪酸MCPD單/雙酯的分離驗證

考慮到不同類型脂肪酸的碳數和單雙鍵數量、空間結構等不同，由此可能導致其洗脫特性不同，需進一步驗證。以不同種類脂肪酸構成的MCPD單酯、MCPD雙酯標準液（十二碳的飽和月桂酸、十六碳的飽和棕櫚酸、十八碳的不飽和亞麻酸、十八碳的飽和硬脂酸）進行實驗。結果表明，6.0 mL正己烷可把上述各類脂肪酸的MCPD雙酯洗脫下來，回收率為92.3%～97.4%，但無法洗脫MCPD單酯，見圖2；但以6.0 mL正己烷酸乙酯（7∶3， V/V）混合液可將MCPD單酯洗脫下來，回收率為93.7%～99.4%，見圖2a；由此可見，優化的方法適用于各類脂肪酸MCPD單酯與雙酯的分離。

3.6檢出限和定量限

在花生油基質中加標，獲得3MCPD單、雙酯和2MCPD雙酯的檢出限（LOD，S/N=3）分別為83， 125和100 μg/kg，定量限（LOQ，S/N=10）分別為278， 417和333 μg/kg。在嬰幼兒奶粉脂肪提取物基質中，3MCPD單、雙酯以及2MCPD雙酯的檢出限略高，分別為95.1， 142和122 μg/kg，脂肪定量限分別為316， 473和406 μg/kg，這說明即使在基質較為復雜的嬰幼兒奶粉脂肪提取物中，方法的檢出限和定量限也滿足分析要求。

3.7線性范圍

3MCPD棕櫚酸單酯與雙酯以及2MCPD二硬脂酸酯含量分別以3MCPD和2MCPD計算。以3MCPD， 2MCPD與各自內標峰面積比值y和各自的質量x（ng）計算線性回歸方程。結果表明，在25～500 ng范圍內線性關系良好，相關系數R2均大于0.9990。

3.8準確度和精密度

3.9實際樣品分析

利用本方法調查了12個品種的72份市售食用植物油樣品和7個品牌31份嬰幼兒配方奶粉中MCPD單/雙酯的含量，同時按文獻 [26] 方法測定脂肪酸MCPD酯總量。結果表明，脂肪中以MCPD雙酯含量為主體，MCPD單酯含量占MCPD酯總量的5.0%～45.0%。此外，利用本方法測定的MCPD單酯、雙酯含量之和占用文獻[21]方法測定MCPD酯總量的71.9%～98.2%，驗證了本方法的可靠性。

本方法操作較為簡便、靈敏度較高、結合內標標準曲線法定量，結果準確可靠，適用于檢測食用植物油和嬰幼兒奶粉中MCPD單酯、雙酯含量的檢測方法。

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