液相色譜·三重四極桿串聯質譜法測定昆蟲對茚蟲威活化代謝活性的差異

高希武等

摘要：采用液相色譜三重四極桿串聯質譜，建立了測定昆蟲對茚蟲威活化代謝（N脫甲氧羰基反應，產物為DCJW）活性的新方法。按本方法制備樣品后30 h內，產物DCJW的化學穩定性較好，5次重復測定的相對標準偏差（RSD）為2.1%。本方法的檢出限為0.01 pg，定量限為0.1 pg；DCJW純乙腈溶液、小菜蛾酶促反應樣品連續進樣、5次獨立酶促反應樣品分別進樣， 3組樣品獨立測定的RSD分別為0.7%， 1.1%， 2.7%； 3種DCJW添加水平（440，880和2200 pg）的回收率為96.1%～102.9%，RSD為4.8%～9.4%；DCJW在46～2310 pg范圍內線性關系良好。本方法靈敏度高，操作方便，適用于昆蟲代謝酶系對茚蟲威的活化代謝活性分析。應用本方法比較了小菜蛾阿維菌素抗性品系與敏感品系對茚蟲威 N脫甲氧羰基代謝活性差異，結果表明，小菜蛾抗性品系對茚蟲威N脫甲氧羰基活性是敏感品系的3.43倍，初步推斷小菜蛾對殺蟲劑阿維菌素和茚蟲威可能存在負交互抗性。

關鍵詞：液相色譜三重四極桿串聯質譜； 茚蟲威； 活化代謝； 小菜蛾

1引言

昆蟲體內介導殺蟲劑直接代謝的酶系主要包括細胞色素P450酶系[1]，水解酶系[2]，以及谷胱甘肽S轉移酶系[3]等。昆蟲代謝酶系催化的殺蟲劑代謝具有重要的毒理學意義，主要表現為解毒代謝與活化代謝，或表現為解毒代謝與活化代謝的某種平衡，其代謝活性高低直接影響著殺蟲劑在昆蟲體內的存在形式、作用機制、生物活性和抗藥性水平等[4]。在昆蟲毒理學研究中，特別是在殺蟲劑抗藥性生化機制研究中，為了表征昆蟲酶系的代謝活性在殺蟲劑代謝抗性機制中的作用，常利用經典的光譜方法（紫外可見光度法或熒光光度法）測定昆蟲對多種模式底物或殺蟲劑類似物的代謝活性來表示[5]。近年來，建立了一些相應的色譜或色譜質譜聯用分析方法[6～9]。然而，利用色譜及色譜質譜聯用技術表征昆蟲對殺蟲劑直接代謝活性的報道卻很少[5]。因為應用模式底物（無論一種還是多種底物）表征昆蟲對殺蟲劑的代謝活性是間接的，而測定昆蟲對殺蟲劑本身的代謝活性則更有說服力[1]，所以開發合適的分析方法，直接測定昆蟲對殺蟲劑的代謝能力，將在昆蟲毒理學研究中有廣泛的應用。

茚蟲威（Indoxacarb， DPXJW062）是美國杜邦公司開發的新型噁二嗪類殺蟲劑，幾乎對所有鱗翅目害蟲都有防效，其作用機理是茚蟲威在鱗翅目昆蟲的脂肪體，特別是中腸內活化代謝為N脫甲氧羰基代謝產物（Ndecarbomethoxyllated indoxacarb， DCJW），DCJW阻斷害蟲神經細胞中Na+通道，使神經細胞喪失功能而導致害蟲死亡[10，11]。目前，尚無測定昆蟲對茚蟲威活化代謝活性方法的報道。本實驗建立了高效液相色譜三重四極桿串聯質譜聯用的多反應監測（MRM）分析方法，用于準確測定昆蟲對茚蟲威的水解活化代謝活性（圖1）[10，11]。本方法選用棉鈴蟲中腸作為酶液，進行MRM分析參數優化，分析方法的建立及確認是通過小菜蛾酶液的代謝反應進行的。MRM分析中，以m/z 267.0為定量離子，m/z 207.0， 150.0為定性離子，通過定量分析產物DCJW的生成量，表征茚蟲威的水解活化代謝活性，用于分析小菜蛾阿維菌素抗性品系與敏感品系對茚蟲威活化代謝活性的差異。

3.5小菜蛾阿維菌素抗性品系與敏感品系的茚蟲威N脫甲氧羰基活性比較

小菜蛾抗性與敏感品系催化茚蟲威的N脫甲氧羰基反應同時進行，結果表明， 小菜蛾阿維菌素抗性品系的茚蟲威N脫甲氧羰基酶活性與敏感品系相比顯著增強，其活性是敏感品系的3.43倍（表2）。這種對茚蟲威活化代謝的增強，初步表明，小菜蛾阿維菌素抗性品系與敏感品系相比，可能對茚蟲威更敏感，即對阿維菌素和茚蟲威可能存在負交互抗性，該結果需要通過小菜蛾抗性與敏感品系對茚蟲威的生物測定來驗證。澳大利亞對菊酯類殺蟲劑產生抗性的棉鈴蟲對殺蟲劑茚蟲威更敏感，因而存在負交互抗性[14]。盡管茚蟲威在鱗翅目昆蟲體內易發生活化代謝，但由于多種抗性機制的存在，昆蟲仍然會對茚蟲威產生不同程度的抗性[15～17]，因此研究昆蟲對茚蟲威的活化代謝活性具有重要的毒理學意義。

3.434結論

本實驗建立了液相色譜三重四極桿串聯質譜MRM模式表征昆蟲對茚蟲威的N脫甲氧羰基代謝活性的新方法，操作方便，省去了常用的有機溶劑萃取、濃縮、定容等步驟。本方法結合了液相色譜的高效分離、三重四極桿串聯質譜MRM分析模式的強定性和高靈敏度的特點，適用于昆蟲對茚蟲威水解活化代謝活性的直接分析，將應用于茚蟲威相關的昆蟲毒理學研究中。

References

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