植物內(nèi)生菌分離時表面消毒條件的比較

王志勇+劉秀娟+易曲

摘要：為了探索植物內(nèi)生菌分離時表面消毒條件的一般規(guī)律，分別用不同消毒劑對水花生的莖處理不同時間，并以最佳組合對植物材料進行消毒處理，放置于分離培養(yǎng)基平板中，在適溫下培養(yǎng)不同時間，觀察各個處理對植物內(nèi)生菌數(shù)量的影響。結(jié)果表明，用5%NaClO浸泡4 min、0.1% HgCl2浸泡0.5 min或先用75%乙醇浸泡0.5 min 再用0.1% HgCl2浸泡0.5 min，分離內(nèi)生菌的效果均較好；0.1% HgCl2浸泡0.5 min后置于分離培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)2 d，內(nèi)生菌數(shù)量極顯著增加。

關(guān)鍵詞：水花生；內(nèi)生菌；分離；表面消毒；富集作用

中圖分類號：Q938.1 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0366-02

由于植物內(nèi)生菌具有促生、抗蟲、抗菌、抗重金屬污染等作用，在調(diào)節(jié)植物生長、促進植物抗病蟲害、抗干旱、固氮等方面有較廣泛的應(yīng)用，并可作為生物工程菌為植物病蟲害的防治提供新的途徑^[1-3]。植物內(nèi)生菌在人類多種疾病的防治、環(huán)境污染降解等方面也有較為廣泛的應(yīng)用^[1-4]。目前，這些應(yīng)用均以得到植物內(nèi)生菌的純培養(yǎng)物為前提，因此植物內(nèi)生菌的分離純化是應(yīng)用研究最關(guān)鍵的一個環(huán)節(jié)。研究人員對近幾年植物內(nèi)生菌的分離方案進行歸納，發(fā)現(xiàn)幾乎沒有一個消毒程序是相同的^[5]。為此，本試驗以莖分節(jié)且中空、輸導(dǎo)組織極發(fā)達的水花生為材料，探索植物內(nèi)生菌分離時表面消毒過程的一般規(guī)律，以期為其他植物內(nèi)生菌的分離提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與預(yù)處理

植物樣品水花生全部采自湖北咸寧職業(yè)技術(shù)學(xué)院校園內(nèi)，樣地土壤為熟化的紅色黏土，主要植被為梔子花、紅花檵木等。采樣時按隨機性原則，采集健康無病蟲害的植株帶回實驗室，切取無受傷、無蟲蛀、無斑點的莖，兩端留節(jié)，每份約1.5 g，流水沖洗1 h備用。

1.2 分離培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。

1.3 表面消毒方案

1.3.1 最適消毒方案的探索 將植物材料按以下方案分別處理：75%乙醇分別浸泡2、4、6、8、10 min（處理1至處理5）；75%乙醇先浸泡2 min，無菌水洗3次，再用5% NaClO分別浸泡2、4、6、8、10 min（處理6至處理10）；5% NaClO分別浸泡2、4、6、8、10 min（處理11至處理15）；0.1%HgCl2分別浸泡0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 min（處理16至處理20）；75%乙醇先浸泡0.5 min，再用0.1% HgCl2分別浸泡0.25、0.50、1.00、1.50 min（處理21至處理24）（表1）。消毒后的植物材料用無菌水洗3次，放在分離培養(yǎng)基平板表面至少1 min，用無菌剪刀將其剪細，加入石英砂研磨后稀釋 10～100 倍，取100 μL 涂布。每處理重復(fù)3次，37 ℃培養(yǎng) 48 h 后計數(shù)^[5]。

3 結(jié)論

植物內(nèi)生菌分離過程中常用的消毒劑主要有乙醇、NaClO 和HgCl2。本研究表明，乙醇不適合單獨用于莖分節(jié)且中空植物的表面消毒。由于NaClO溶液易揮發(fā)且不易久存（保存期約1年），因此在用于植物內(nèi)生菌分離時要盡量使用新鮮的NaClO溶液。HgCl2盡管對人體及環(huán)境有一定副作用，但因其濃度穩(wěn)定、消毒效果好且所需時間少，分離得到的內(nèi)生菌數(shù)量較穩(wěn)定，因此比較適合用于植物內(nèi)生菌，尤其是莖分節(jié)且中空植物內(nèi)生菌的分離。

由于植物種類、部位、生境、生長時期等存在差異，研究人員在進行植物內(nèi)生菌分離時采用的消毒方案往往各不相同，其原則是盡可能殺死植物表面微生物的同時，應(yīng)獲得最大量的內(nèi)生菌。由于植物體內(nèi)與體外的環(huán)境差別較大，分離得到的大多數(shù)植物內(nèi)生菌在分離培養(yǎng)基中生長較慢，而也會有一些內(nèi)生菌在分離培養(yǎng)基上生長較快，因此在培養(yǎng)1 d后需要觀察1次，2 d 后再計數(shù)，3 d后再復(fù)核1次。另外，植物內(nèi)生菌在分離過程中通常設(shè)漂洗對照、印跡對照、環(huán)境對照^[5]，而本研究只設(shè)置了印跡對照，是因為水花生的莖經(jīng)消毒后再用無菌水清洗3次，放入培養(yǎng)皿時材料本身黏附了約100 μL左右的漂洗液，因此無需再設(shè)漂洗對照。

為了獲得在自然界中數(shù)量少或難培養(yǎng)的微生物，通常要進行富集培養(yǎng)，就是用一定的選擇性培養(yǎng)基，使樣品中所含的特殊微生物數(shù)量從混雜的微生物類群中經(jīng)培養(yǎng)后得到提高，便于分離^[6]。微生物的富集培養(yǎng)和分離技術(shù)在土壤、水、空氣或生活垃圾微生物的分離純化中有廣泛的應(yīng)用，但在植物內(nèi)生菌的分離中卻鮮見報道。本研究將水花生的莖經(jīng)乙醇與HgCl2配合消毒后，再置于分離培養(yǎng)基平板中在適宜溫度下培養(yǎng)過夜，其實質(zhì)是為植物內(nèi)生菌創(chuàng)造了良好的溫、濕度條件，促使這些內(nèi)生菌數(shù)量增加，有利于其分離與純化，可認為是對植物內(nèi)生菌的一種富集作用，這與Thomas等的研究結(jié)果^[7-8]一致。

參考文獻：

[1]肖淑賢，高俊明. 植物內(nèi)生菌的研究概況及應(yīng)用進展[J]. 農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備，2011，01B（2）：74-77.

[2]盧鎮(zhèn)岳，楊新芳，馮永君. 植物內(nèi)生細菌的分離、分類、定殖與應(yīng)用[J]. 生命科學(xué)，2006，18（1）：90-94.

[3]王莉莉，戴志聰，祁珊珊，等. 植物內(nèi)生細菌及其對入侵生態(tài)學(xué)的啟示[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（3）：9-12.

[4]Yenn T W，Lee C C，Ibrahim D，et al. Enhancement of anti-candidal activity of endophytic fungus Phomopsis sp .ED2，isolated from Orthosiphon stamineus Benth，by incorporation of host plant extract in culture medium[J]. Journal of Microbiology，2012，50（4）：581-585.

[5]王利娟，賀新生. 植物內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)的研究方法[J]. 微生物學(xué)雜志，2006，26（4）：55-60.

[6]祝優(yōu)珍，仇玉蘭，袁 濤. 環(huán)境衛(wèi)生生物學(xué)與監(jiān)測技術(shù)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007：165.

[7]Thomas P，Soly T A. Endophytic bacteria associated with growing shoot tips of banana （Musa sp.） cv. grand naine and the affinity of endophytes to the host[J]. Microbial Ecology，2009，58（4）：952-964.

[8]Vendan R T，Yu Y J，Lee S H，et al. Diversity of endophytic bacteria in ginseng and their potential for plant growth promotion[J]. Journal of Microbiology，2010，48（5）：559-565.endprint

摘要：為了探索植物內(nèi)生菌分離時表面消毒條件的一般規(guī)律，分別用不同消毒劑對水花生的莖處理不同時間，并以最佳組合對植物材料進行消毒處理，放置于分離培養(yǎng)基平板中，在適溫下培養(yǎng)不同時間，觀察各個處理對植物內(nèi)生菌數(shù)量的影響。結(jié)果表明，用5%NaClO浸泡4 min、0.1% HgCl2浸泡0.5 min或先用75%乙醇浸泡0.5 min 再用0.1% HgCl2浸泡0.5 min，分離內(nèi)生菌的效果均較好；0.1% HgCl2浸泡0.5 min后置于分離培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)2 d，內(nèi)生菌數(shù)量極顯著增加。

關(guān)鍵詞：水花生；內(nèi)生菌；分離；表面消毒；富集作用

中圖分類號：Q938.1 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0366-02

由于植物內(nèi)生菌具有促生、抗蟲、抗菌、抗重金屬污染等作用，在調(diào)節(jié)植物生長、促進植物抗病蟲害、抗干旱、固氮等方面有較廣泛的應(yīng)用，并可作為生物工程菌為植物病蟲害的防治提供新的途徑^[1-3]。植物內(nèi)生菌在人類多種疾病的防治、環(huán)境污染降解等方面也有較為廣泛的應(yīng)用^[1-4]。目前，這些應(yīng)用均以得到植物內(nèi)生菌的純培養(yǎng)物為前提，因此植物內(nèi)生菌的分離純化是應(yīng)用研究最關(guān)鍵的一個環(huán)節(jié)。研究人員對近幾年植物內(nèi)生菌的分離方案進行歸納，發(fā)現(xiàn)幾乎沒有一個消毒程序是相同的^[5]。為此，本試驗以莖分節(jié)且中空、輸導(dǎo)組織極發(fā)達的水花生為材料，探索植物內(nèi)生菌分離時表面消毒過程的一般規(guī)律，以期為其他植物內(nèi)生菌的分離提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與預(yù)處理

植物樣品水花生全部采自湖北咸寧職業(yè)技術(shù)學(xué)院校園內(nèi)，樣地土壤為熟化的紅色黏土，主要植被為梔子花、紅花檵木等。采樣時按隨機性原則，采集健康無病蟲害的植株帶回實驗室，切取無受傷、無蟲蛀、無斑點的莖，兩端留節(jié)，每份約1.5 g，流水沖洗1 h備用。

1.2 分離培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。

1.3 表面消毒方案

1.3.1 最適消毒方案的探索 將植物材料按以下方案分別處理：75%乙醇分別浸泡2、4、6、8、10 min（處理1至處理5）；75%乙醇先浸泡2 min，無菌水洗3次，再用5% NaClO分別浸泡2、4、6、8、10 min（處理6至處理10）；5% NaClO分別浸泡2、4、6、8、10 min（處理11至處理15）；0.1%HgCl2分別浸泡0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 min（處理16至處理20）；75%乙醇先浸泡0.5 min，再用0.1% HgCl2分別浸泡0.25、0.50、1.00、1.50 min（處理21至處理24）（表1）。消毒后的植物材料用無菌水洗3次，放在分離培養(yǎng)基平板表面至少1 min，用無菌剪刀將其剪細，加入石英砂研磨后稀釋 10～100 倍，取100 μL 涂布。每處理重復(fù)3次，37 ℃培養(yǎng) 48 h 后計數(shù)^[5]。

3 結(jié)論

植物內(nèi)生菌分離過程中常用的消毒劑主要有乙醇、NaClO 和HgCl2。本研究表明，乙醇不適合單獨用于莖分節(jié)且中空植物的表面消毒。由于NaClO溶液易揮發(fā)且不易久存（保存期約1年），因此在用于植物內(nèi)生菌分離時要盡量使用新鮮的NaClO溶液。HgCl2盡管對人體及環(huán)境有一定副作用，但因其濃度穩(wěn)定、消毒效果好且所需時間少，分離得到的內(nèi)生菌數(shù)量較穩(wěn)定，因此比較適合用于植物內(nèi)生菌，尤其是莖分節(jié)且中空植物內(nèi)生菌的分離。

由于植物種類、部位、生境、生長時期等存在差異，研究人員在進行植物內(nèi)生菌分離時采用的消毒方案往往各不相同，其原則是盡可能殺死植物表面微生物的同時，應(yīng)獲得最大量的內(nèi)生菌。由于植物體內(nèi)與體外的環(huán)境差別較大，分離得到的大多數(shù)植物內(nèi)生菌在分離培養(yǎng)基中生長較慢，而也會有一些內(nèi)生菌在分離培養(yǎng)基上生長較快，因此在培養(yǎng)1 d后需要觀察1次，2 d 后再計數(shù)，3 d后再復(fù)核1次。另外，植物內(nèi)生菌在分離過程中通常設(shè)漂洗對照、印跡對照、環(huán)境對照^[5]，而本研究只設(shè)置了印跡對照，是因為水花生的莖經(jīng)消毒后再用無菌水清洗3次，放入培養(yǎng)皿時材料本身黏附了約100 μL左右的漂洗液，因此無需再設(shè)漂洗對照。

為了獲得在自然界中數(shù)量少或難培養(yǎng)的微生物，通常要進行富集培養(yǎng)，就是用一定的選擇性培養(yǎng)基，使樣品中所含的特殊微生物數(shù)量從混雜的微生物類群中經(jīng)培養(yǎng)后得到提高，便于分離^[6]。微生物的富集培養(yǎng)和分離技術(shù)在土壤、水、空氣或生活垃圾微生物的分離純化中有廣泛的應(yīng)用，但在植物內(nèi)生菌的分離中卻鮮見報道。本研究將水花生的莖經(jīng)乙醇與HgCl2配合消毒后，再置于分離培養(yǎng)基平板中在適宜溫度下培養(yǎng)過夜，其實質(zhì)是為植物內(nèi)生菌創(chuàng)造了良好的溫、濕度條件，促使這些內(nèi)生菌數(shù)量增加，有利于其分離與純化，可認為是對植物內(nèi)生菌的一種富集作用，這與Thomas等的研究結(jié)果^[7-8]一致。

參考文獻：

[1]肖淑賢，高俊明. 植物內(nèi)生菌的研究概況及應(yīng)用進展[J]. 農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備，2011，01B（2）：74-77.

[2]盧鎮(zhèn)岳，楊新芳，馮永君. 植物內(nèi)生細菌的分離、分類、定殖與應(yīng)用[J]. 生命科學(xué)，2006，18（1）：90-94.

[3]王莉莉，戴志聰，祁珊珊，等. 植物內(nèi)生細菌及其對入侵生態(tài)學(xué)的啟示[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（3）：9-12.

[4]Yenn T W，Lee C C，Ibrahim D，et al. Enhancement of anti-candidal activity of endophytic fungus Phomopsis sp .ED2，isolated from Orthosiphon stamineus Benth，by incorporation of host plant extract in culture medium[J]. Journal of Microbiology，2012，50（4）：581-585.

[5]王利娟，賀新生. 植物內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)的研究方法[J]. 微生物學(xué)雜志，2006，26（4）：55-60.

[6]祝優(yōu)珍，仇玉蘭，袁 濤. 環(huán)境衛(wèi)生生物學(xué)與監(jiān)測技術(shù)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007：165.

[7]Thomas P，Soly T A. Endophytic bacteria associated with growing shoot tips of banana （Musa sp.） cv. grand naine and the affinity of endophytes to the host[J]. Microbial Ecology，2009，58（4）：952-964.

[8]Vendan R T，Yu Y J，Lee S H，et al. Diversity of endophytic bacteria in ginseng and their potential for plant growth promotion[J]. Journal of Microbiology，2010，48（5）：559-565.endprint

摘要：為了探索植物內(nèi)生菌分離時表面消毒條件的一般規(guī)律，分別用不同消毒劑對水花生的莖處理不同時間，并以最佳組合對植物材料進行消毒處理，放置于分離培養(yǎng)基平板中，在適溫下培養(yǎng)不同時間，觀察各個處理對植物內(nèi)生菌數(shù)量的影響。結(jié)果表明，用5%NaClO浸泡4 min、0.1% HgCl2浸泡0.5 min或先用75%乙醇浸泡0.5 min 再用0.1% HgCl2浸泡0.5 min，分離內(nèi)生菌的效果均較好；0.1% HgCl2浸泡0.5 min后置于分離培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)2 d，內(nèi)生菌數(shù)量極顯著增加。

關(guān)鍵詞：水花生；內(nèi)生菌；分離；表面消毒；富集作用

中圖分類號：Q938.1 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0366-02

由于植物內(nèi)生菌具有促生、抗蟲、抗菌、抗重金屬污染等作用，在調(diào)節(jié)植物生長、促進植物抗病蟲害、抗干旱、固氮等方面有較廣泛的應(yīng)用，并可作為生物工程菌為植物病蟲害的防治提供新的途徑^[1-3]。植物內(nèi)生菌在人類多種疾病的防治、環(huán)境污染降解等方面也有較為廣泛的應(yīng)用^[1-4]。目前，這些應(yīng)用均以得到植物內(nèi)生菌的純培養(yǎng)物為前提，因此植物內(nèi)生菌的分離純化是應(yīng)用研究最關(guān)鍵的一個環(huán)節(jié)。研究人員對近幾年植物內(nèi)生菌的分離方案進行歸納，發(fā)現(xiàn)幾乎沒有一個消毒程序是相同的^[5]。為此，本試驗以莖分節(jié)且中空、輸導(dǎo)組織極發(fā)達的水花生為材料，探索植物內(nèi)生菌分離時表面消毒過程的一般規(guī)律，以期為其他植物內(nèi)生菌的分離提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與預(yù)處理

植物樣品水花生全部采自湖北咸寧職業(yè)技術(shù)學(xué)院校園內(nèi)，樣地土壤為熟化的紅色黏土，主要植被為梔子花、紅花檵木等。采樣時按隨機性原則，采集健康無病蟲害的植株帶回實驗室，切取無受傷、無蟲蛀、無斑點的莖，兩端留節(jié)，每份約1.5 g，流水沖洗1 h備用。

1.2 分離培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。

1.3 表面消毒方案

1.3.1 最適消毒方案的探索 將植物材料按以下方案分別處理：75%乙醇分別浸泡2、4、6、8、10 min（處理1至處理5）；75%乙醇先浸泡2 min，無菌水洗3次，再用5% NaClO分別浸泡2、4、6、8、10 min（處理6至處理10）；5% NaClO分別浸泡2、4、6、8、10 min（處理11至處理15）；0.1%HgCl2分別浸泡0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 min（處理16至處理20）；75%乙醇先浸泡0.5 min，再用0.1% HgCl2分別浸泡0.25、0.50、1.00、1.50 min（處理21至處理24）（表1）。消毒后的植物材料用無菌水洗3次，放在分離培養(yǎng)基平板表面至少1 min，用無菌剪刀將其剪細，加入石英砂研磨后稀釋 10～100 倍，取100 μL 涂布。每處理重復(fù)3次，37 ℃培養(yǎng) 48 h 后計數(shù)^[5]。

3 結(jié)論

植物內(nèi)生菌分離過程中常用的消毒劑主要有乙醇、NaClO 和HgCl2。本研究表明，乙醇不適合單獨用于莖分節(jié)且中空植物的表面消毒。由于NaClO溶液易揮發(fā)且不易久存（保存期約1年），因此在用于植物內(nèi)生菌分離時要盡量使用新鮮的NaClO溶液。HgCl2盡管對人體及環(huán)境有一定副作用，但因其濃度穩(wěn)定、消毒效果好且所需時間少，分離得到的內(nèi)生菌數(shù)量較穩(wěn)定，因此比較適合用于植物內(nèi)生菌，尤其是莖分節(jié)且中空植物內(nèi)生菌的分離。

由于植物種類、部位、生境、生長時期等存在差異，研究人員在進行植物內(nèi)生菌分離時采用的消毒方案往往各不相同，其原則是盡可能殺死植物表面微生物的同時，應(yīng)獲得最大量的內(nèi)生菌。由于植物體內(nèi)與體外的環(huán)境差別較大，分離得到的大多數(shù)植物內(nèi)生菌在分離培養(yǎng)基中生長較慢，而也會有一些內(nèi)生菌在分離培養(yǎng)基上生長較快，因此在培養(yǎng)1 d后需要觀察1次，2 d 后再計數(shù)，3 d后再復(fù)核1次。另外，植物內(nèi)生菌在分離過程中通常設(shè)漂洗對照、印跡對照、環(huán)境對照^[5]，而本研究只設(shè)置了印跡對照，是因為水花生的莖經(jīng)消毒后再用無菌水清洗3次，放入培養(yǎng)皿時材料本身黏附了約100 μL左右的漂洗液，因此無需再設(shè)漂洗對照。

為了獲得在自然界中數(shù)量少或難培養(yǎng)的微生物，通常要進行富集培養(yǎng)，就是用一定的選擇性培養(yǎng)基，使樣品中所含的特殊微生物數(shù)量從混雜的微生物類群中經(jīng)培養(yǎng)后得到提高，便于分離^[6]。微生物的富集培養(yǎng)和分離技術(shù)在土壤、水、空氣或生活垃圾微生物的分離純化中有廣泛的應(yīng)用，但在植物內(nèi)生菌的分離中卻鮮見報道。本研究將水花生的莖經(jīng)乙醇與HgCl2配合消毒后，再置于分離培養(yǎng)基平板中在適宜溫度下培養(yǎng)過夜，其實質(zhì)是為植物內(nèi)生菌創(chuàng)造了良好的溫、濕度條件，促使這些內(nèi)生菌數(shù)量增加，有利于其分離與純化，可認為是對植物內(nèi)生菌的一種富集作用，這與Thomas等的研究結(jié)果^[7-8]一致。

參考文獻：

[1]肖淑賢，高俊明. 植物內(nèi)生菌的研究概況及應(yīng)用進展[J]. 農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備，2011，01B（2）：74-77.

[2]盧鎮(zhèn)岳，楊新芳，馮永君. 植物內(nèi)生細菌的分離、分類、定殖與應(yīng)用[J]. 生命科學(xué)，2006，18（1）：90-94.

[3]王莉莉，戴志聰，祁珊珊，等. 植物內(nèi)生細菌及其對入侵生態(tài)學(xué)的啟示[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（3）：9-12.

[4]Yenn T W，Lee C C，Ibrahim D，et al. Enhancement of anti-candidal activity of endophytic fungus Phomopsis sp .ED2，isolated from Orthosiphon stamineus Benth，by incorporation of host plant extract in culture medium[J]. Journal of Microbiology，2012，50（4）：581-585.

[5]王利娟，賀新生. 植物內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)的研究方法[J]. 微生物學(xué)雜志，2006，26（4）：55-60.

[6]祝優(yōu)珍，仇玉蘭，袁 濤. 環(huán)境衛(wèi)生生物學(xué)與監(jiān)測技術(shù)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007：165.

[7]Thomas P，Soly T A. Endophytic bacteria associated with growing shoot tips of banana （Musa sp.） cv. grand naine and the affinity of endophytes to the host[J]. Microbial Ecology，2009，58（4）：952-964.

[8]Vendan R T，Yu Y J，Lee S H，et al. Diversity of endophytic bacteria in ginseng and their potential for plant growth promotion[J]. Journal of Microbiology，2010，48（5）：559-565.endprint