液體發酵法發酵豆粕產蛋白酶條件的優化

王偉+王世英+朱寶成

摘要：為了提高B-15菌株發酵豆粕產蛋白酶能力，采用單因素法對 B-15菌株發酵培養基所需的碳源、氮源、無機鹽進行篩選，采用正交試驗對B-15菌株的發酵培養基組成及發酵培養條件進行優化，最終確定最適發酵培養基組成為葡萄糖為2%、豆粕濃度為12%、KCl為0.01%、MgSO4為0.05%。通過發酵工藝條件參數的正交優化試驗得出發酵培養基的最佳工藝參數為：發酵時間為48 h，裝瓶量為50 mL，種齡為14 h，pH值為6.5。在此條件下B-15菌株發酵產蛋白酶活力為125.05 U/mL，與基礎發酵培養基相比，提高了11.9%。

關鍵詞：液體發酵；發酵條件；正交優化；蛋白酶活力

中圖分類號：TQ920.1 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0273-03

大豆肽是一種比大豆蛋白質更為優質、新型的大豆蛋白酶改性產品，廣泛應用于發酵、制藥、食品、化妝品、飼料及植物營養劑等行業^[1-3]。大豆肽易消化吸收，能迅速供給機體能量，無蛋白變性，無豆腥味，液體黏性小和受熱不凝固等，并具有降低血清膽固醇^[4]、降低血壓、抗疲勞^[5]、抗氧化^[6]等許多生物功能，因此大豆肽成為研究熱點。目前，大豆肽多采用酶解法和微生物發酵法生產^[7]，微生物發酵法把蛋白酶的發酵生產和大豆肽的酶解生產有機結合在一起，降低了大豆肽功能的生產成本，克服了酶水解法制備大豆肽產品的苦味大和口感差等缺點^[8]。目前，利用微生物發酵法生產大豆肽被認為是較先進有效方法，應用前景較好。本試驗以蛋白酶活力為指標，通過單因素和正交試驗對產蛋白酶芽孢桿菌 B-15 發酵處理豆粕的產酶培養基組成、發酵工藝條件進行了優化，以確定最佳的豆粕發酵產酶工藝，為大豆肽的大規模液態發酵生產奠定堅實基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 細菌菌株：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）B-15，由河北農業大學生命科學學院制藥工程實驗室分離并保存。

1.1.2 培養基 NA培養基、NB培養基的配制詳見文獻[9]。種子培養基即NB培養基；基礎發酵培養基：豆粕10%、Na2HPO4 0.84%、KH2PO4 0.032%、CaCl2 0.17%、混勻后調pH值6.0～6.5。

1.1.3 試劑

福林-酚試劑；0.55 mol/L 碳酸鈉溶液、10% 三氯醋酸溶液、0.02 mol/L pH值7.5磷酸緩沖液、1%酪蛋白溶液、100 μg/mL標準酪氨酸溶液，所用試劑皆為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的培養與發酵

1.2.1.1 搖瓶種子曲線（生長曲線）及種子培養

將斜面培養的菌株接種于NB培養基中，250 mL三角瓶中的裝瓶量為75 mL（250 mL，下同），在37 ℃下180 r/min振蕩培養，在零時開始取樣，以后每隔1 h或2 h取樣1次，直至培養24 h為止，以未接菌的培養基作空白調零，用分光光度計在600 nm下測D，以發酵時間為x軸、以D為y軸作曲線，繪制生長曲線。將斜面培養的菌株接種于NB培養基中，裝瓶量為 75 mL，180 r/min搖床培養，培養時間由生長曲線確定，得到種子液。

1.2.1.2 發酵培養

對培養基成分采用以下的培養條件進行優化：將種子液以2%的接種量接入75 mL/250 mL三角瓶發酵培養基中，于37 ℃、180 r/min下振蕩培養48 h，將發酵液在5 000 r/min條件下離心10 min，棄去沉淀，收集上清液，進行蛋白酶活力測定。

1.2.2 單因素試驗

1.2.2.1 不同碳源

分別以2%的蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉、玉米淀粉、D-果糖等7種碳源進行B-15菌株產酶活力比較試驗，配制7種碳源不同的發酵培養基，均加入10%氮源豆粕，0.84% Na2HPO4，0.032% KH2PO4，0.17% CaCl2，混勻后調pH值6.0～6.5，篩選出最適碳源。

1.2.2.2 不同氮源濃度

配制豆粕濃度分別為2%、5%、8%、11%、14%的培養基發酵培養，進行B-15菌株產酶活力比較試驗，均加入2%最適碳源，0.84% Na2HPO4、0.032% KH2PO4、0.17% CaCl2，混勻后調pH值6.0～6.5，篩選出最適氮源濃度。

1.2.2.3 不同無機鹽

以濃度為0.05%的CaCl2、MgSO4、FeSO4、MnCl2、KCl、NaCl、ZnCl2等7種供試無機鹽進行B-15菌株產酶活力比較試驗，配制7種無機鹽不同的發酵培養基，均加入2%最適碳源，最適氮源濃度的豆粕，0.84% Na2HPO4、0.032% KH2PO4，混勻后調pH值6.0～6.5，篩選出最適2種無機鹽。

1.2.3 正交試驗

1.2.3.1 培養基組分

在培養基各組分初步篩選的基礎上，研究培養基成分的不同配比對酶活力的影響。選用L16（44）設計方案設計4因素4水平正交試驗（表1），根據上述試驗確定的最適碳源、氮源、無機鹽配制不同組成的培養基，測定發酵菌株產酶活力。綜合正交試驗結果，初步確定最佳組合，得出B-15菌株產酶的最佳培養基組成。

肽發酵培養基最佳組成，即葡萄糖為2%，豆粕濃度為12%，KCl為0.01%，MgSO4為0.05%。通過對其進行發酵工藝條件參數的正交優化試驗得出發酵培養基的最佳工藝參數，即發酵時間為48 h，裝瓶量為50 mL，種齡為14 h，pH值為6.5。在此條件下，B-15菌株發酵產蛋白酶活力為125.05 U/mL，與基礎發酵培養基相比提高了11.9%，研究結果為進一步利用豆粕提供了理論依據。

參考文獻：

[1]豆康寧，董 彬，王銀滿. 大豆蛋白活性肽的生物功能與應用前景[J]. 糧食加工，2007，32（2）：52-54.

[2]鄧成萍，張 惠，魏秀英.大豆低聚肽的研究進展[J]. 食品科學，2004，25（增刊）：236-240.

[3]王 靜，郝再彬. 大豆肽的特性和功能及研究進展[J]. 黑龍江農業科學，2004（5）：32-36.

[4]宋俊梅，曲靜然，徐少萍. 大豆肽的研究進展（待續）[J]. 山東輕工業學院學報，2002，16（3）：1-3.

[5]鄭哲君，李曉莉，王 朔. 抗疲勞功能食品的研究進展[J]. 食品科技，2006，31（2）：4-7.

[6]Chen H M，Muramoto K，Yamauchi F. Structural analysis of antioxidative peptides from soybean β-conglycinin[J]. Agric and Food Chem，1995，43（5）：574-578.

[7]方海紅，胡好遠，黃紅英，等. 微生物堿性蛋白酶的研究進展[J]. 微生物學通報，2002，29（2）：57-59.

[8]鄧 勇，吳煜歡. 微生物蛋白酶對大豆分離蛋白水解作用的研究[J]. 食品科學，1999，20（6）：42-45.

[9]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，2001：351.

[10]Iemura Y，Yamada T，Takahashi T，et al. Properties of the peptides liberated from rice protein in sokujo-moto[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，1999，88（3）：276-280.

[11]李志忠，袁惠君，張丙云，等. 大豆多肽的功能與開發研究[J]. 甘肅科技，2006，22（4）：179-181.endprint

摘要：為了提高B-15菌株發酵豆粕產蛋白酶能力，采用單因素法對 B-15菌株發酵培養基所需的碳源、氮源、無機鹽進行篩選，采用正交試驗對B-15菌株的發酵培養基組成及發酵培養條件進行優化，最終確定最適發酵培養基組成為葡萄糖為2%、豆粕濃度為12%、KCl為0.01%、MgSO4為0.05%。通過發酵工藝條件參數的正交優化試驗得出發酵培養基的最佳工藝參數為：發酵時間為48 h，裝瓶量為50 mL，種齡為14 h，pH值為6.5。在此條件下B-15菌株發酵產蛋白酶活力為125.05 U/mL，與基礎發酵培養基相比，提高了11.9%。

關鍵詞：液體發酵；發酵條件；正交優化；蛋白酶活力

中圖分類號：TQ920.1 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0273-03

大豆肽是一種比大豆蛋白質更為優質、新型的大豆蛋白酶改性產品，廣泛應用于發酵、制藥、食品、化妝品、飼料及植物營養劑等行業^[1-3]。大豆肽易消化吸收，能迅速供給機體能量，無蛋白變性，無豆腥味，液體黏性小和受熱不凝固等，并具有降低血清膽固醇^[4]、降低血壓、抗疲勞^[5]、抗氧化^[6]等許多生物功能，因此大豆肽成為研究熱點。目前，大豆肽多采用酶解法和微生物發酵法生產^[7]，微生物發酵法把蛋白酶的發酵生產和大豆肽的酶解生產有機結合在一起，降低了大豆肽功能的生產成本，克服了酶水解法制備大豆肽產品的苦味大和口感差等缺點^[8]。目前，利用微生物發酵法生產大豆肽被認為是較先進有效方法，應用前景較好。本試驗以蛋白酶活力為指標，通過單因素和正交試驗對產蛋白酶芽孢桿菌 B-15 發酵處理豆粕的產酶培養基組成、發酵工藝條件進行了優化，以確定最佳的豆粕發酵產酶工藝，為大豆肽的大規模液態發酵生產奠定堅實基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 細菌菌株：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）B-15，由河北農業大學生命科學學院制藥工程實驗室分離并保存。

1.1.2 培養基 NA培養基、NB培養基的配制詳見文獻[9]。種子培養基即NB培養基；基礎發酵培養基：豆粕10%、Na2HPO4 0.84%、KH2PO4 0.032%、CaCl2 0.17%、混勻后調pH值6.0～6.5。

1.1.3 試劑

福林-酚試劑；0.55 mol/L 碳酸鈉溶液、10% 三氯醋酸溶液、0.02 mol/L pH值7.5磷酸緩沖液、1%酪蛋白溶液、100 μg/mL標準酪氨酸溶液，所用試劑皆為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的培養與發酵

1.2.1.1 搖瓶種子曲線（生長曲線）及種子培養

將斜面培養的菌株接種于NB培養基中，250 mL三角瓶中的裝瓶量為75 mL（250 mL，下同），在37 ℃下180 r/min振蕩培養，在零時開始取樣，以后每隔1 h或2 h取樣1次，直至培養24 h為止，以未接菌的培養基作空白調零，用分光光度計在600 nm下測D，以發酵時間為x軸、以D為y軸作曲線，繪制生長曲線。將斜面培養的菌株接種于NB培養基中，裝瓶量為 75 mL，180 r/min搖床培養，培養時間由生長曲線確定，得到種子液。

1.2.1.2 發酵培養

對培養基成分采用以下的培養條件進行優化：將種子液以2%的接種量接入75 mL/250 mL三角瓶發酵培養基中，于37 ℃、180 r/min下振蕩培養48 h，將發酵液在5 000 r/min條件下離心10 min，棄去沉淀，收集上清液，進行蛋白酶活力測定。

1.2.2 單因素試驗

1.2.2.1 不同碳源

分別以2%的蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉、玉米淀粉、D-果糖等7種碳源進行B-15菌株產酶活力比較試驗，配制7種碳源不同的發酵培養基，均加入10%氮源豆粕，0.84% Na2HPO4，0.032% KH2PO4，0.17% CaCl2，混勻后調pH值6.0～6.5，篩選出最適碳源。

1.2.2.2 不同氮源濃度

配制豆粕濃度分別為2%、5%、8%、11%、14%的培養基發酵培養，進行B-15菌株產酶活力比較試驗，均加入2%最適碳源，0.84% Na2HPO4、0.032% KH2PO4、0.17% CaCl2，混勻后調pH值6.0～6.5，篩選出最適氮源濃度。

1.2.2.3 不同無機鹽

以濃度為0.05%的CaCl2、MgSO4、FeSO4、MnCl2、KCl、NaCl、ZnCl2等7種供試無機鹽進行B-15菌株產酶活力比較試驗，配制7種無機鹽不同的發酵培養基，均加入2%最適碳源，最適氮源濃度的豆粕，0.84% Na2HPO4、0.032% KH2PO4，混勻后調pH值6.0～6.5，篩選出最適2種無機鹽。

1.2.3 正交試驗

1.2.3.1 培養基組分

在培養基各組分初步篩選的基礎上，研究培養基成分的不同配比對酶活力的影響。選用L16（44）設計方案設計4因素4水平正交試驗（表1），根據上述試驗確定的最適碳源、氮源、無機鹽配制不同組成的培養基，測定發酵菌株產酶活力。綜合正交試驗結果，初步確定最佳組合，得出B-15菌株產酶的最佳培養基組成。

肽發酵培養基最佳組成，即葡萄糖為2%，豆粕濃度為12%，KCl為0.01%，MgSO4為0.05%。通過對其進行發酵工藝條件參數的正交優化試驗得出發酵培養基的最佳工藝參數，即發酵時間為48 h，裝瓶量為50 mL，種齡為14 h，pH值為6.5。在此條件下，B-15菌株發酵產蛋白酶活力為125.05 U/mL，與基礎發酵培養基相比提高了11.9%，研究結果為進一步利用豆粕提供了理論依據。

參考文獻：

[1]豆康寧，董 彬，王銀滿. 大豆蛋白活性肽的生物功能與應用前景[J]. 糧食加工，2007，32（2）：52-54.

[2]鄧成萍，張 惠，魏秀英.大豆低聚肽的研究進展[J]. 食品科學，2004，25（增刊）：236-240.

[3]王 靜，郝再彬. 大豆肽的特性和功能及研究進展[J]. 黑龍江農業科學，2004（5）：32-36.

[4]宋俊梅，曲靜然，徐少萍. 大豆肽的研究進展（待續）[J]. 山東輕工業學院學報，2002，16（3）：1-3.

[5]鄭哲君，李曉莉，王 朔. 抗疲勞功能食品的研究進展[J]. 食品科技，2006，31（2）：4-7.

[6]Chen H M，Muramoto K，Yamauchi F. Structural analysis of antioxidative peptides from soybean β-conglycinin[J]. Agric and Food Chem，1995，43（5）：574-578.

[7]方海紅，胡好遠，黃紅英，等. 微生物堿性蛋白酶的研究進展[J]. 微生物學通報，2002，29（2）：57-59.

[8]鄧 勇，吳煜歡. 微生物蛋白酶對大豆分離蛋白水解作用的研究[J]. 食品科學，1999，20（6）：42-45.

[9]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，2001：351.

[10]Iemura Y，Yamada T，Takahashi T，et al. Properties of the peptides liberated from rice protein in sokujo-moto[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，1999，88（3）：276-280.

[11]李志忠，袁惠君，張丙云，等. 大豆多肽的功能與開發研究[J]. 甘肅科技，2006，22（4）：179-181.endprint

摘要：為了提高B-15菌株發酵豆粕產蛋白酶能力，采用單因素法對 B-15菌株發酵培養基所需的碳源、氮源、無機鹽進行篩選，采用正交試驗對B-15菌株的發酵培養基組成及發酵培養條件進行優化，最終確定最適發酵培養基組成為葡萄糖為2%、豆粕濃度為12%、KCl為0.01%、MgSO4為0.05%。通過發酵工藝條件參數的正交優化試驗得出發酵培養基的最佳工藝參數為：發酵時間為48 h，裝瓶量為50 mL，種齡為14 h，pH值為6.5。在此條件下B-15菌株發酵產蛋白酶活力為125.05 U/mL，與基礎發酵培養基相比，提高了11.9%。

關鍵詞：液體發酵；發酵條件；正交優化；蛋白酶活力

中圖分類號：TQ920.1 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0273-03

大豆肽是一種比大豆蛋白質更為優質、新型的大豆蛋白酶改性產品，廣泛應用于發酵、制藥、食品、化妝品、飼料及植物營養劑等行業^[1-3]。大豆肽易消化吸收，能迅速供給機體能量，無蛋白變性，無豆腥味，液體黏性小和受熱不凝固等，并具有降低血清膽固醇^[4]、降低血壓、抗疲勞^[5]、抗氧化^[6]等許多生物功能，因此大豆肽成為研究熱點。目前，大豆肽多采用酶解法和微生物發酵法生產^[7]，微生物發酵法把蛋白酶的發酵生產和大豆肽的酶解生產有機結合在一起，降低了大豆肽功能的生產成本，克服了酶水解法制備大豆肽產品的苦味大和口感差等缺點^[8]。目前，利用微生物發酵法生產大豆肽被認為是較先進有效方法，應用前景較好。本試驗以蛋白酶活力為指標，通過單因素和正交試驗對產蛋白酶芽孢桿菌 B-15 發酵處理豆粕的產酶培養基組成、發酵工藝條件進行了優化，以確定最佳的豆粕發酵產酶工藝，為大豆肽的大規模液態發酵生產奠定堅實基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 細菌菌株：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）B-15，由河北農業大學生命科學學院制藥工程實驗室分離并保存。

1.1.2 培養基 NA培養基、NB培養基的配制詳見文獻[9]。種子培養基即NB培養基；基礎發酵培養基：豆粕10%、Na2HPO4 0.84%、KH2PO4 0.032%、CaCl2 0.17%、混勻后調pH值6.0～6.5。

1.1.3 試劑

福林-酚試劑；0.55 mol/L 碳酸鈉溶液、10% 三氯醋酸溶液、0.02 mol/L pH值7.5磷酸緩沖液、1%酪蛋白溶液、100 μg/mL標準酪氨酸溶液，所用試劑皆為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種的培養與發酵

1.2.1.1 搖瓶種子曲線（生長曲線）及種子培養

將斜面培養的菌株接種于NB培養基中，250 mL三角瓶中的裝瓶量為75 mL（250 mL，下同），在37 ℃下180 r/min振蕩培養，在零時開始取樣，以后每隔1 h或2 h取樣1次，直至培養24 h為止，以未接菌的培養基作空白調零，用分光光度計在600 nm下測D，以發酵時間為x軸、以D為y軸作曲線，繪制生長曲線。將斜面培養的菌株接種于NB培養基中，裝瓶量為 75 mL，180 r/min搖床培養，培養時間由生長曲線確定，得到種子液。

1.2.1.2 發酵培養

對培養基成分采用以下的培養條件進行優化：將種子液以2%的接種量接入75 mL/250 mL三角瓶發酵培養基中，于37 ℃、180 r/min下振蕩培養48 h，將發酵液在5 000 r/min條件下離心10 min，棄去沉淀，收集上清液，進行蛋白酶活力測定。

1.2.2 單因素試驗

1.2.2.1 不同碳源

分別以2%的蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉、玉米淀粉、D-果糖等7種碳源進行B-15菌株產酶活力比較試驗，配制7種碳源不同的發酵培養基，均加入10%氮源豆粕，0.84% Na2HPO4，0.032% KH2PO4，0.17% CaCl2，混勻后調pH值6.0～6.5，篩選出最適碳源。

1.2.2.2 不同氮源濃度

配制豆粕濃度分別為2%、5%、8%、11%、14%的培養基發酵培養，進行B-15菌株產酶活力比較試驗，均加入2%最適碳源，0.84% Na2HPO4、0.032% KH2PO4、0.17% CaCl2，混勻后調pH值6.0～6.5，篩選出最適氮源濃度。

1.2.2.3 不同無機鹽

以濃度為0.05%的CaCl2、MgSO4、FeSO4、MnCl2、KCl、NaCl、ZnCl2等7種供試無機鹽進行B-15菌株產酶活力比較試驗，配制7種無機鹽不同的發酵培養基，均加入2%最適碳源，最適氮源濃度的豆粕，0.84% Na2HPO4、0.032% KH2PO4，混勻后調pH值6.0～6.5，篩選出最適2種無機鹽。

1.2.3 正交試驗

1.2.3.1 培養基組分

在培養基各組分初步篩選的基礎上，研究培養基成分的不同配比對酶活力的影響。選用L16（44）設計方案設計4因素4水平正交試驗（表1），根據上述試驗確定的最適碳源、氮源、無機鹽配制不同組成的培養基，測定發酵菌株產酶活力。綜合正交試驗結果，初步確定最佳組合，得出B-15菌株產酶的最佳培養基組成。

肽發酵培養基最佳組成，即葡萄糖為2%，豆粕濃度為12%，KCl為0.01%，MgSO4為0.05%。通過對其進行發酵工藝條件參數的正交優化試驗得出發酵培養基的最佳工藝參數，即發酵時間為48 h，裝瓶量為50 mL，種齡為14 h，pH值為6.5。在此條件下，B-15菌株發酵產蛋白酶活力為125.05 U/mL，與基礎發酵培養基相比提高了11.9%，研究結果為進一步利用豆粕提供了理論依據。

參考文獻：

[1]豆康寧，董 彬，王銀滿. 大豆蛋白活性肽的生物功能與應用前景[J]. 糧食加工，2007，32（2）：52-54.

[2]鄧成萍，張 惠，魏秀英.大豆低聚肽的研究進展[J]. 食品科學，2004，25（增刊）：236-240.

[3]王 靜，郝再彬. 大豆肽的特性和功能及研究進展[J]. 黑龍江農業科學，2004（5）：32-36.

[4]宋俊梅，曲靜然，徐少萍. 大豆肽的研究進展（待續）[J]. 山東輕工業學院學報，2002，16（3）：1-3.

[5]鄭哲君，李曉莉，王 朔. 抗疲勞功能食品的研究進展[J]. 食品科技，2006，31（2）：4-7.

[6]Chen H M，Muramoto K，Yamauchi F. Structural analysis of antioxidative peptides from soybean β-conglycinin[J]. Agric and Food Chem，1995，43（5）：574-578.

[7]方海紅，胡好遠，黃紅英，等. 微生物堿性蛋白酶的研究進展[J]. 微生物學通報，2002，29（2）：57-59.

[8]鄧 勇，吳煜歡. 微生物蛋白酶對大豆分離蛋白水解作用的研究[J]. 食品科學，1999，20（6）：42-45.

[9]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，2001：351.

[10]Iemura Y，Yamada T，Takahashi T，et al. Properties of the peptides liberated from rice protein in sokujo-moto[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，1999，88（3）：276-280.

[11]李志忠，袁惠君，張丙云，等. 大豆多肽的功能與開發研究[J]. 甘肅科技，2006，22（4）：179-181.endprint