3種冠環線蟲體表結構的掃描電鏡觀察

卜艷珍+王美心+趙鵬飛+張路平

摘要：首次應用掃描電鏡技術對冠狀冠環線蟲（Coronocyclus coronatus）、大唇片冠環線蟲（C. labiatus）和小唇片冠環線蟲（C. labratus）的體表結構特征進行觀察和比較。結果表明，3種線蟲的形態特征存在明顯差異。冠狀冠環線蟲外葉冠由22個小葉組成；4個亞中乳突起自口領基部，向口領頂部延伸呈隆起狀；雄蟲生殖錐背唇上有1對卵圓形結構的附屬物，中部相融合，上面分布著許多剛毛狀突起；雌蟲尾部直。大唇片冠環線蟲外葉冠小葉19個；口領內上緣在背腹面和側面向內延伸形成4個大的唇形結構，每個唇片的基部中央伸出1個亞中乳突；雄蟲生殖錐背唇上約分布著10個大小不等的圓錐形附屬物；雌蟲尾部稍彎向背側。小唇片冠環線蟲外葉冠小葉18個；口領內上緣在背腹面和側面向內延伸形成4個小的唇形結構，每個唇片的基部中央伸出1個亞中乳突；雄蟲生殖錐背唇上有1個兩端呈卵圓的月牙形附屬物；雌蟲尾部直。

關鍵詞：冠狀冠環線蟲；大唇片冠環線蟲；小唇片冠環線蟲；體表結構；掃描電鏡

中圖分類號：Q959.17；S432.4+5 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0214-04

冠環屬（Coronocyclus）線蟲隸屬于圓線目（Strongylida）圓線科（Strongylidae）盅口亞科（Cyathostominae），是馬屬動物腸道內感染率較高的寄生圓線蟲，往往造成宿主消瘦、貧血甚至死亡^[1-5]。1986年，德國學者Hartwich對盅口族（Cyathostominea）線蟲進行了分類修訂，根據角質支環與口囊壁前端完全分開這一特征建立了一個新屬——冠環屬（Coronocyclus），并將盅口屬（Cyathostomum）的4個種移入該屬，即冠狀冠環線蟲（C. coronatus）、大唇片冠環線蟲（C. labiatus）、小唇片冠環線蟲（C. labratus）和箭狀冠環線蟲（C. sagittatus）^[6]。隨后，Dvojnos等又發現了一個新種，命名為尤氏冠環線蟲（C. ulambajari）^[7]。近幾年來，筆者對河南省驢腸道寄生線蟲的感染情況進行了調查，僅采集到冠狀冠環線蟲、大唇片冠環線蟲和小唇片冠環線蟲3種冠環線蟲。盡管國內外學者在光鏡下已經對這3種線蟲作了詳細的描述^[8-10]，但是尚未見掃描電鏡的相關報道。由于掃描電鏡技術可以更直觀、更清晰地觀察到線蟲的體表結構特征，因此被廣泛應用于線蟲的分類鑒定^[11-14]。本研究首次應用掃描電鏡技術對冠環屬3種線蟲的體表特征進行觀察和比較，不僅可以為線蟲的分類鑒定提供更多、更具體的形態學依據，同時還可以為馬屬動物線蟲病的診斷和防治提供參考依據。

1 材料與方法

采自河南省驢腸道內的線蟲標本經過處理后，固定保存于70%乙醇中。固定標本先用乳酸苯酚溶液（2份甘油、1份苯酚飽和溶液、1份乳酸、1份水）透明，然后在光學顯微鏡下進行形態學初步鑒定，種類鑒定主要采用張路平等提出的分類系統標準[8-9，15]。標本保存于河南師范大學生命科學學院。

挑選冠環屬3種線蟲雌雄蟲體各5頭，用于掃描電鏡觀察。先用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH值 7.2）充分漂洗干凈，再用2.5%戊二醛固定3 h，經磷酸緩沖液漂洗后，放入1%鋨酸固定1.5 h，再經磷酸緩沖液漂洗，各級乙醇梯度脫水，醋酸異戊酯置換，CO2臨界點干燥，噴金鍍膜后，在S-570掃描電鏡下觀察和拍照（工作電壓15 kV）。

2 結果與分析

2.1 冠狀冠環線蟲

口領顯著，頭部頂面觀呈圓形。4個亞中乳突起自口領基部向頂部延伸呈隆起狀，到達口領頂部后，突出口領之上呈子彈形（圖1-1、圖1-2、圖1-3），乳突長9.7～11.8 μm（10.9 μm）。口領頂端兩側各有1個頭感器，頭感器小，稍微隆起，中間有一裂縫（圖1-4）。口孔較大，近似圓形，直徑為39.4～41.3 μm（40.2 μm）。口孔周圍環繞著1圈外葉冠，由22個小葉組成，小葉長18.3～26.1 μm（22.5 μm），基部寬3.4～4.6 μm（4.1 μm），小葉末端鈍圓，有的伸向口孔，有的向外翻卷。外葉冠的起始部位低于口領表面（圖1-2、圖1-3）。

雄蟲（n=5）：體長7.45～8.51 mm（7.92 mm），最大體寬341.3～392.5 μm（370.2 μm）。尾部具有發達的交合傘，由1個較長的背葉和2個卵圓形的側葉組成，背葉和側葉分界明顯（圖1-5、圖1-6）。生殖錐短，由腹唇和背唇組成，兩唇之間的橫裂即為泄殖孔。背唇上有1對卵圓形結構的附屬物，中部相融合，上面分布著許多剛毛狀突起（圖1-7）。

雌蟲（n=5）：體長8.90～10.09 mm（10.01 mm），最大體寬372.4～453.2 μm（411.7 μm）。尾部直，尾尖呈指形。陰門卵圓形，靠近肛門。肛門橫裂，呈月牙形（圖1-8、圖1-9）。陰門距肛門110.2～120.4 μm（116.3 μm），肛門距尾端174.2～194.1 μm（183.5 μm）。

2.2 大唇片冠環線蟲

口領顯著， 頭部頂面觀呈圓形。口領內上緣在背腹面和側面向內延伸形成4個大的唇形結構，每個唇片的基部中央伸出1個亞中乳突，亞中乳突的大部分與唇片結合在一起，只有頂部游離在唇片的外面（圖2-1、圖2-2、圖2-3），乳突長6.1～7.2 μm（6.8 μm）。口領頂端兩側各有1個頭感器，頭感器小，稍微隆起，中間有一裂縫（圖2-3）。口孔較大，近似圓形，直徑41.5～46.8 μm（44.3 μm）。口孔周圍環繞著1外葉冠，由19個小葉組成，小葉長26.7～29.3 μm（27.4 μm），基部寬4.2～5.3 μm（4.7 μm），小葉末端鈍圓，向外翻卷。外葉冠的起始部位低于口領的表面（圖2-3、圖2-4）。endprint

雄蟲（n=5）：體長7.65～8.19 mm（7.94 mm），最大體寬312.6～428.3 μm（364.7 μm）。尾部具有發達的交合傘，背葉較寬闊，稍長于側葉，背葉和側葉分界不明顯（圖2-5、圖2-6）。生殖錐短，卵圓形，由腹唇和背唇組成，兩唇之間的橫裂即為泄殖孔。背唇上分布著約10個大小不等的圓錐形附屬物（圖2-7）。

雌蟲（n=5）：體長9.76～11.23 mm（10.54 mm），最大體寬413.6～542.3 μm（486.7 μm）。尾部粗壯，稍彎向背側，尾尖呈指形。陰門卵圓形，靠近肛門。肛門橫裂，呈月牙形（圖2-8、圖2-9）。陰門距肛門105.3～116.4 μm（112.1 μm），肛門距尾端131.7～162.5 μm（143.9 μm）。

2.3 小唇片冠環線蟲

口領顯著，頭部頂面觀呈圓形。口領內上緣在背腹面和側面向內延伸形成4個小的唇形結構，每個唇片的基部中央伸出1個亞中乳突，亞中乳突僅基部與唇片結合在一起，其他大部分游離在唇片的外面（圖3-1、圖3-2、圖3-3），乳突長5.9～6.8 μm（6.3 μm）。口領頂端兩側各有1個頭感器，頭感器小，稍微隆起，中間有一裂縫（圖3-2）。口孔稍小，近似圓形，直徑為32.6～35.5 μm（34.7 μm）。口孔周圍環繞著1圈外葉冠，由18個小葉組成，小葉長11.4～19.6 μm（16.3 μm），基部寬2.4～4.3 μm（3.5 μm），小葉末端鈍圓，有的伸向口孔，有的向外翻卷。外葉冠的起始部位低于口領表面（圖3-1、圖3-2）。

雄蟲（n=5）：體長5.67～6.78 mm（6.54 mm），最大體寬238.4～297.1 μm（254.8 μm）。尾部具有發達的交合傘，由1個稍長的背葉和2個卵圓形的側葉組成，背葉和側葉分界明顯（圖3-4、圖3-5）。生殖錐短小，由腹唇和背唇組成，兩唇之間的橫裂即為泄殖孔。背唇上有1個月牙狀的附屬物，兩端呈卵圓形（圖3-6、圖3-7）。

[CM（24]雌蟲（n=5）：體長6.96～7.92 mm（7.68 mm），最大體寬294.8～345.3 μm（328.2 μm）。尾部直，尾尖呈指形。陰門卵圓形，靠近肛門。肛門橫裂，呈月牙形（圖3-8、圖3-9）。陰門距肛門64.2～87.1 μm（76.4 μm），肛門距尾端86.3～98.2 μm（92.5 μm）。

3 結論與討論

首次采用掃描電鏡對冠環屬3種線蟲的體表結構進行了詳細的觀察和描述，結果發現3種線蟲外部形態特征具有明顯的差異：（1）冠狀冠環線蟲的外葉冠由22個小葉組成，小葉長18.3～26.1 μm（22.5 μm），基部寬3.4～4.6 μm（4.1 μm）；大唇片冠環線蟲外葉冠小葉為19個，小葉長 26.7～29.3 μm（27.4 μm），基部寬4.2～5.3 μm（4.7 μm）；小唇片冠環線蟲為18個小葉，小葉長11.4～19.6 μm（16.3 μm），基部寬2.4～4.3 μm（3.5 μm）。外葉冠形態特征的差異是鑒定圓線蟲種類的重要依據之一，外葉冠的形狀和數量在光鏡下有時難以辨別，但在掃描電鏡下可以觀察得十分清楚。在以往的報道中，只是對外葉冠小葉的數量進行了描述^[8-10]，而本研究提供了更多、更具體的形態特征。（2）冠狀冠環線蟲的4個亞中乳突起自口領基部，向口領頂部延伸呈隆起狀；大唇片冠環線蟲口領內上緣在背腹面和側面向內延伸形成4個大的唇形結構；小唇片冠環線蟲口領內上緣在背腹面和側面向內延伸形成4個小的唇形結構。從觀察結果來看，冠環屬3種線蟲亞中乳突基部的形態特征明顯不同。大唇片冠環線蟲和小唇片冠環線蟲的頭部特征比較相似，只是大唇片冠環線蟲的口領基部形成4個特別顯著的唇形隆起，而小唇片冠環線蟲形成的唇形隆起小而低，與光鏡下的觀察結果^[8-10]一致。（3）冠狀冠環線蟲雄蟲生殖錐背唇上有1對卵圓形結構的附屬物，中部相融合，上面分布著許多剛毛狀突起；大唇片冠環線蟲生殖錐背唇上約有10個大小不等的圓錐形附屬物；小唇片冠環線蟲生殖錐上有1個兩端呈卵圓的月牙形附屬物。生殖錐一般包埋在雄蟲交合傘下面，不易被觀察，而在掃描電鏡下，生殖錐的立體感較強，結構非常清晰。本結果與Lichtenfels等的描述^[9]稍有不同。在Lichtenfels等的報道中，大唇片冠環線蟲生殖錐上有2對圓錐形突起，而小唇片冠環線蟲生殖錐上有1對梨形附屬物，中部相融合。筆者認為產生這些差異的原因可能有2個：一是由于地理分布不同造成的種內變異；二是由于在光鏡下生殖錐附屬物形態結構不容易分辨，使得研究者的描述和看法不同。（4）冠狀冠環線蟲雌蟲尾部直，尾長174.2～194.1 μm（183.5 μm）；大唇片冠環線蟲尾部粗壯，稍彎向背側，尾長131.7～162.5 μm（143.9 μm）；小唇片冠環線蟲尾部直，尾長86.3～98.2 μm（92.5 μm）。3種線蟲雌蟲尾部形態與以往的報道^[8-10]基本一致。本研究結果進一步證明，通過掃描電鏡能夠清晰、準確地觀察到線蟲的體表結構特征，可以為線蟲的分類鑒定提供更多、更詳細的形態鑒別依據。

參考文獻：

[1]Bu Y Z，Niu H X，Gasser R B，et al. Strongyloid nematodes in the caeca of donkeys in Henan Province，China[J]. Acta Parasitologica，2009，54（3）：263-268.

[2]Lyons E T，Kuzmina T A，Tolliver S C. Observations on development of natural infection and species composition of small strongyles in young equids in Kentucky[J]. Parasitology Research，2011，109（6）：1529-1535.endprint

[3]Lester H E，Spanton J，Stratford C H，et al. Anthelmintic efficacy against cyathostomins in horses in Southern England[J]. Veterinary Parasitology，2013，197（1/2）：189-196.

[4]Matthews J B，Burden F A. Common helminth infections of donkeys and their control in temperate regions[J]. Equine Veterinary Education，2013，25（9）：461-467.

[5]Flanagan K L，Morton J M，Sandeman R M. Prevalence of infestation with gastrointestinal nematodes in Pony Club horses in Victoria[J]. Australian Veterinary Journal，2013，91（6）：241-245.

[6]Hartwich G. Zum strongylus tetracanthus-problem and zur systematik der Cyathostominea（Nematode：Strongyloidea）[J]. Mitt Zool Mus Berl，1986，62：61-102.

[7]Dvojnos G M，Kharchenko V A，Lichtenfels J R. Coronocyclus ulambajari n. sp.（Nematoda：Strongyloidea） from horses of Mongolia[J]. Journal of Parasitology，1994，80（2）：312-316.

[8]張路平，孔繁瑤. 馬屬動物的寄生線蟲[M]. 北京：中國農業出版社，2002：53-62.[HJ1.8mm]

[9]Lichtenfels J R，Kharchenko V A，Dvojnos G M. Illustrated identification keys to strongylid parasites（Strongylidae：Nematoda）of horses，zebras and asses（Equidae）[J]. Veterinary Parasitology，2008，156（1/2）：4-161.

[10]卜艷珍，王艷梅，張學成.河南省驢寄生圓線蟲的種類記述——冠環屬Coronocyclus[J]. 河南師范大學學報：自然科學版，2009，37（6）：112-115.

[11]Li L，Xu Z，Zhang L P. Redescription of three species of Hysterothylacium（Nematoda：Anisakidae）from marine fishes from the Yellow Sea，China，with the synonymy of Hysterothylacium muraenesoxin （Luo，1999）[J]. Zootaxa，2008（1878）：55-67.

[12]史梅青，張 莉，張路平. 山西和陜西兩省鳥類寄生異刺屬線蟲的研究（線蟲綱：異刺科）[J]. 四川動物，2010，29（4）：527-535.

[13]張樹乾，劉寶臣，張路平. 北京猛禽兩種旋尾類寄生線蟲的報道（線蟲綱，旋尾目）[J]. 動物分類學報，2012，37（3）：535-541.

[14]卜艷珍，王小攀，趙鵬飛，等. 盅口屬三種線蟲掃描電鏡的比較研究（桿形目，圓線科）[J]. 動物分類學報，2013，38（1）：27-32.

[15]Lichtenfels J R，Kharchenko V A，Krecek R C，et al. An annotated checklist by genus and species of 93 species level names for 51 recognized species of small strongyles（Nematoda：Strongyloidea：Cyathostominea）of horses，asses and zebras of the world[J]. Veterinary Parasitology，1998，79（1）：65-79.endprint