雞源芽孢益生菌JM—42菌株篩選及抑菌物性質(zhì)分析

司賀龍+郭云霞+孫志穎+郝慶紅+劉月琴

摘要：為了篩選對(duì)雛雞腹瀉具有顯著預(yù)防作用的芽孢益生菌，采用瓊脂平板擴(kuò)散法，以大腸桿菌菌株為病源指示菌，從健康雞腸道中篩選到1株具有較強(qiáng)抑菌活性的拮抗細(xì)菌JM-42菌株，對(duì)該菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化、16S rDNA 序列分析，同時(shí)采用有機(jī)溶劑萃取和鹽析法對(duì)其代謝產(chǎn)物進(jìn)行提取，對(duì)其產(chǎn)物物質(zhì)種類及性質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，JM-42菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株Bacillus velezensis的同源性最高，為99.92%，且二者在所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上的同一分支上，最終鑒定JM-42菌株為B. velezensis。通過對(duì)其代謝產(chǎn)物進(jìn)行初步分析得出，其拮抗物質(zhì)為蛋白質(zhì)，50%硫酸銨鹽析所得到的蛋白質(zhì)組分活性最強(qiáng)，且對(duì)熱及酸堿敏感性較弱，性質(zhì)比較穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：雞；芽孢益生菌；篩選；鑒定；抗菌蛋白

中圖分類號(hào)：S852.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2014）08-0208-04

益生菌是指通過攝取適當(dāng)?shù)牧?，能夠起到有效作用的活菌，它是通過調(diào)節(jié)腸道微生物生態(tài)平衡，改善腸道防御功能、維護(hù)腸道屏障功能的微生態(tài)制劑^[1-2]。目前，歐盟等國(guó)家均出臺(tái)了相應(yīng)政策、法律來嚴(yán)格限制甚至禁止抗生素的使用，作為抗生素功能的替代品，微生態(tài)制劑以其無污染、無殘留、促生長(zhǎng)并具有提高免疫力、促消化的功能而受到人們的關(guān)注。芽孢桿菌可以形成芽孢的兼性厭氧菌，具有很強(qiáng)的抗逆性，而且還可以產(chǎn)生多種消化酶及維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)^[3]，且芽孢細(xì)菌后期的規(guī)模化生產(chǎn)可操作性強(qiáng)，易于推廣應(yīng)用，因此成為目前微生態(tài)制劑的首選菌種。幼齡動(dòng)物由于生長(zhǎng)發(fā)育不完全，易受到環(huán)境、飼料、疾病的影響，導(dǎo)致一些消化道疾病，為了保證益生菌進(jìn)入機(jī)體內(nèi)的活性及定植，本試驗(yàn)從健康雞腸道中篩選對(duì)致病性大腸桿菌有顯著拮抗作用的芽孢菌株，并對(duì)其抑菌物質(zhì)進(jìn)行初步分析，為雞源芽孢益生菌的后期研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

致病性大腸桿菌，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程系實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 樣品采集

新鮮的健康雞腸道，取自河北省清苑縣某肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.3 培養(yǎng)基

細(xì)菌用培養(yǎng)基包括NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基^[4]；

生理生化鑒定用培養(yǎng)基依據(jù)鑒定手冊(cè)中的方法^[5]進(jìn)行配制。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 雞源芽孢桿菌的分離

從健康雞新鮮盲腸中取1 g內(nèi)容物，溶于10 mL無菌水中，80 ℃水浴滅菌20 min。用無菌水10倍梯度稀釋，取適當(dāng)稀釋梯度的懸液在平板上涂布，每個(gè)稀釋度涂布3個(gè)平板，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，獲得單菌落。挑取不同形態(tài)單菌落轉(zhuǎn)接到NA培養(yǎng)基斜面上純培養(yǎng)，每個(gè)平板劃4個(gè)菌，編號(hào)，記錄。

1.4.2 雞源芽孢桿菌的初篩和復(fù)篩

將不同菌落分別轉(zhuǎn)接到含大腸桿菌的病原菌平板上，與大腸桿菌對(duì)峙生長(zhǎng)，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。觀察是否有抑菌圈出現(xiàn)，進(jìn)而挑選出形成抑菌圈的菌株，置于-4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

從初篩的拮抗細(xì)菌中選出抑菌活性較高的菌進(jìn)行復(fù)篩。將挑選出來的菌株，以NA培養(yǎng)基活化后，接種于NB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h后，取用0.2 μm微孔濾膜過濾除菌的拮抗細(xì)菌發(fā)酵液約15 μL，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量并記錄抑菌圈直徑。

1.4.3 雞源芽孢桿菌JM-42菌株的種屬鑒定

根據(jù)菌株的菌落形態(tài)特征、菌體形態(tài)特征、革蘭氏染色性狀、芽孢染色性狀、有關(guān)生理生化鑒別試驗(yàn)，參照文獻(xiàn)[5]與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行屬和種的鑒定。

1.4.4 雞源芽孢桿菌JM-42菌株的生理生化鑒定

按照相應(yīng)屬、種鑒定的有關(guān)內(nèi)容進(jìn)行生理生化鑒定。試驗(yàn)要求分別進(jìn)行接觸酶試驗(yàn)、H2S產(chǎn)生試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、氨基酸脫羧酶試驗(yàn)、淀粉水解、V-P試驗(yàn)、M.R試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用和糖、醇發(fā)酵等。

1.4.5 雞源芽孢桿菌JM-42菌株的16S rDNA的鑒定

1.4.5.1 雞源芽孢桿菌JM-42菌株基因組DNA的提取及其PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌株的發(fā)酵液（培養(yǎng)4～12 h）750 μL至EP管中，4 ℃下10 000 r/min離心 10 min，重復(fù)3次。用無菌水振蕩洗沉淀2次（洗殘留的發(fā)酵液），4 ℃下10 000 r/min離心10 min。加400 μL TE（Tris-HCl和EDTA混合液）溶解沉淀。液面下加入20 μL溶菌酶（50 mg/mL），輕輕搖勻混合，置于37 ℃溫育過夜，間歇搖動(dòng)EP管，加400 μL CTAB，65 ℃水浴40 min。冷卻至室溫，加入400 μL酚-三氯甲烷（1 ∶1），輕輕混勻，4 ℃下12 000 r/min離心10 min。移取上清，加入350 μL三氯甲烷，輕輕混勻，4 ℃ 下12 000 r/min 離心10 min。取上清，加入等體積冰凍異丙醇，輕輕搖勻，置于-20 ℃冰箱 1～4 h，沉淀DNA。取出后，12 000 r/min 離心10 min。沉淀以75%乙醇洗2次，風(fēng)干（至完全去除乙醇?xì)馕叮?，得到DNA粗品。

純化DNA：加入200 μL TE溶解沉淀，液面下加入RNA酶（20 mg/mL），37 ℃保溫30 min。加入400 μL 酚-三氯甲烷（1 ∶1），輕輕混勻，4 ℃下12 000 r/min離心10 min。移取上清，加入350 μL三氯甲烷，輕輕混勻，4 ℃下12 000 r/min離心10 min。取上清，加入1/10體積的2 mol/L KAc溶液和2倍體積的無水乙醇，置于-20 ℃保藏1～12 h。取出，4 ℃下 10 000 r/min 離心10 min。用75%乙醇洗2次，風(fēng)干。加 20～30 μL TE溶解沉淀，于-20 ℃保藏。endprint

凡是離心后吸取上清液的步驟，必須使用處理過的槍頭。剪去槍尖2 mm左右，目的是減少對(duì)DNA片段的剪切力，提高收率。

JM-42的基因組DNA擴(kuò)增引物為細(xì)菌的16S rDNA通用引物，正向引物PrimerA：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物PrimerB：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR擴(kuò)增的條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃ 退火40 s，72 ℃延伸90 s，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后，送往上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.4.5.2 雞源芽孢桿菌JM-42菌株16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹繪制

利用BLAST方式將測(cè)定好的JM-42菌株的16S rDNA序列與GenBank中所有已測(cè)定的芽孢桿菌屬16S rDNA基因序列進(jìn)行同源序列分析比對(duì)，選取序列相似性高的菌株用ClustaX 1.8軟件對(duì)比序列的相似性，并利用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.6 雞源芽孢桿菌JM-42菌株的產(chǎn)物性質(zhì)分析

1.4.6.1 溶劑萃取

將JM-42菌株活化后用NB培養(yǎng)基進(jìn)行靜置液體發(fā)酵。取48 h發(fā)酵液4份，每份100 mL，離心后分別用1/3體積的三氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液在通風(fēng)處內(nèi)自然揮發(fā)至干燥，分別用5.0 mL蒸餾水溶解后，用瓊脂打孔擴(kuò)散法在病原菌平板上測(cè)定抗菌活性，在同一平板上同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液、萃余液的抗菌活性，并以蒸餾水作為陰性對(duì)照、發(fā)酵液作陽性對(duì)照。

1.4.6.2 硫酸銨鹽析

取48 h發(fā)酵液200 mL，離心后在不斷攪拌情況下緩慢添加硫酸銨30%、60%、80%飽和度，于 4 ℃ 冰箱沉淀過夜，10 000 r/min離心10 min得沉淀，加 0.01 mol/L Tris-HCl（pH值7.4）緩沖液溶解，透析，凍干。用0.01 mol/L Tris-HCl（pH值7.4），經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，制成10 mg/mL抗菌物溶液，用于拮抗活性測(cè)定。用瓊脂打孔擴(kuò)散法在病原菌平板上測(cè)定透析液抗菌活性，在同一平板上同時(shí)作蒸餾水陰性對(duì)照和發(fā)酵液陽性對(duì)照。

1.4.6.3 粗蛋白穩(wěn)定性研究

將粗提拮抗蛋白用無菌水配成濃度為10 mg/mL的溶液。分別測(cè)定粗蛋白對(duì)熱、pH值的穩(wěn)定性和對(duì)胰蛋白酶的敏感性，從而初步判斷抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性。

粗蛋白熱穩(wěn)定性的測(cè)定：將拮抗蛋白的粗提取液分別在40、60、80、100 ℃以及0.1 MPa、121 ℃各處理20 min，然后進(jìn)行抑菌活性的測(cè)定。以常溫處理的蛋白液作對(duì)照，25 ℃培養(yǎng)2 d后觀察抑菌結(jié)果，并測(cè)量抑菌圈直徑，比較分析結(jié)果。

粗蛋白pH值穩(wěn)定性的測(cè)定：將拮抗蛋白的粗提液與磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液等體積混合，再用0.01 mol/L鹽酸或氫氧化鈉分別調(diào)pH值至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0進(jìn)行抑菌活性的測(cè)定，25 ℃培養(yǎng)2 d后觀察抑菌結(jié)果，以瓊脂打孔擴(kuò)散法，觀察不同pH值發(fā)酵液的抑菌效果，比較分析結(jié)果。

粗蛋白對(duì)胰蛋白酶的敏感性：將抗菌粗蛋白提取液分裝于Ep管中，1 ∶1加入2 mg/mL胰蛋白酶溶液，以加無菌水的發(fā)酵上清液作對(duì)照，用瓊脂打孔擴(kuò)散法，在病原菌平板上選擇合適的間距打孔，作3個(gè)平行，在37 ℃恒溫孵育0、0.5、1.0、1.5、2.0 h，觀察經(jīng)胰蛋白酶處理不同時(shí)間的抗菌粗蛋白的抑菌效果，測(cè)量抑菌圈直徑作記錄。以上各處理和對(duì)照分別用抑菌圈法測(cè)定其抑菌活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌的初篩

將分離得到的不同特征的耐高溫單菌落經(jīng)純化后分別與大腸桿菌進(jìn)行對(duì)峙生長(zhǎng)試驗(yàn)，從初篩的70株拮抗細(xì)菌中選出抑菌活性較高的20株菌進(jìn)行復(fù)篩。

2.2 拮抗細(xì)菌的復(fù)篩

對(duì)20株形態(tài)不同的活性較高的菌株進(jìn)行復(fù)篩，共分離得到具有較高拮抗作用的菌株5株，其抑菌圈直徑均不小于 11 mm（表1），其中菌株JM-42抑菌圈直徑為14.2 mm，能有效抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)。

3 結(jié)論與討論

芽孢益生菌作為微生態(tài)制劑的一種重要來源細(xì)菌，在維護(hù)動(dòng)物腸道健康、促進(jìn)微生態(tài)平衡等方面發(fā)揮著重要的作用。芽孢細(xì)菌在逆境環(huán)境下形成芽孢，在溫度、pH值、營(yíng)養(yǎng)條件適粗時(shí)萌發(fā)生長(zhǎng)，產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，發(fā)揮其益生作用。但芽孢桿菌在常規(guī)動(dòng)物腸道發(fā)揮生理功能，可能是通過與其他微生物相互作用的結(jié)果，而非單一的芽孢桿菌在倡導(dǎo)生長(zhǎng)代謝造成的^[7]。通過拮抗作用來篩選益生菌，是最直接有效的途徑^[8]。本試驗(yàn)從雞腸道中篩選出對(duì)致病性大腸桿菌具有顯著拮抗作用的菌株，經(jīng)復(fù)篩可以確定，JM-42菌株的代謝產(chǎn)物中含有較高的抑菌活性物質(zhì)，能產(chǎn)生有效的抑菌作用，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化、16S rDNA序列分析得出雞源JM-42菌株為Bacillus velezensis。

細(xì)菌素是某些細(xì)菌產(chǎn)生的具有抗菌活性的多肽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物^[9]，目前由益生菌中的乳酸菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素有40余種^[10]。益生菌中的乳酸菌在代謝過程中除細(xì)菌素外，還能產(chǎn)生乙酸、乳酸及過氧化氫等具有抑菌活性的物質(zhì)。因此，為了排除這些非細(xì)菌素物質(zhì)的干擾，本研究利用硫酸銨鹽析對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行粗蛋白的分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50%硫酸銨對(duì)粗蛋白提取量最大，抑菌效果最明顯。因此，證明了JM-42菌株發(fā)酵液中提取物的抗菌活性是類細(xì)菌素所致，而不是有機(jī)酸和過氧化氫所致。

JM-42抗菌蛋白在較廣泛的pH范圍內(nèi)都有較好的抑菌活性，酸堿適應(yīng)性較強(qiáng)；在外界溫度為40 ℃時(shí)抑菌活性最強(qiáng)，但在40～100 ℃ 下抑菌活性稍有減弱，在121 ℃下明顯有所減弱，但在此溫度下仍有抑菌圈出現(xiàn)，說明JM-42抗菌蛋白粗提液具有較好的熱穩(wěn)定性。20世紀(jì)80年代初，Hultmark等研究在滯育德惜比古天蠶蛹中利用大腸桿菌誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)一類新型的抗菌蛋白，該蛋白分子量在7 ku，不同于溶菌酶的15 ku，與氨基酸組成相似，具有熱穩(wěn)定性^[11]，與申吉泓等報(bào)道^[12]一致。在用胰蛋白酶處理孵育的過程中仍出現(xiàn)抑菌圈，說明該抗菌粗蛋白對(duì)胰蛋白酶不敏感。JM-42作為飼料添加劑應(yīng)用于飼料中，在動(dòng)物消化道產(chǎn)生的抗菌蛋白不會(huì)被胰蛋白酶降解，能發(fā)揮其抗菌作用?？咕某煞譃橐紫盏陌被?，可作為畜禽飼料添加劑取代或部分取代目前飼喂動(dòng)物所用的抗生素，減少抗生素對(duì)動(dòng)物體的危害。目前，利用酵母產(chǎn)生抗菌肽酵母制劑，在預(yù)防及治療仔豬白痢、雛雞白痢方面有明顯效果?？傊?，該蛋白質(zhì)性質(zhì)較穩(wěn)定，耐熱耐酸能力強(qiáng)，對(duì)病原細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制能力，由蛋白類物質(zhì)或非單一抗菌物質(zhì)所組成，有關(guān)其組分和結(jié)構(gòu)鑒定方面須要進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果為益生菌的進(jìn)一步應(yīng)用提供技術(shù)支持。endprint

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