鉬對小鼠睪丸NO含量及ATPase活性的影響

林霖+任洪濤+張才+李健+王宏偉+楊自軍

摘要：為探討鉬對小鼠睪丸NO含量及ATPase活性的影響，選用60只雄性昆明種小鼠，隨機分成對照組、鉬100組、鉬200組、鉬400組共4組，即飲水中分別添加0、100、200、400 mg/L鉬（鉬源為鉬酸鈉），連續染毒90 d，檢測小鼠睪丸組織形態結構，睪丸組織NO含量及ATP酶活性。結果表明，鉬染毒小鼠睪丸生精細胞變性，精子減少，睪丸組織NO含量升高，睪丸組織Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的活性下降，這可能是鉬導致雄性小鼠生殖障礙的毒性機制。

關鍵詞：鉬；睪丸；NO；ATP酶；小鼠

中圖分類號：S858.91 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0195-02

鉬是動物必需的微量元素，是黃嘌呤氧化酶、醛氧化酶的重要組成成分，參與機體的生長發育及核酸代謝；鉬也是一種金屬毒物，當過量的鉬進入動物機體時，不僅會造成肝、腎等組織臟器損傷^[1-2]，還會影響動物生殖系統的結構與功能^[3]。本研究通過檢測鉬對小鼠睪丸組織ATP酶活性和NO含量的影響，為探討鉬對雄性小鼠生殖毒作用機制提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 清潔級健康昆明種雄性小白鼠60只，體重（16±1） g/只，由河南科技大學實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑 鉬酸鈉分析純，天津市化學試劑四廠生產；NO測試盒、總蛋白測試盒及ATP酶試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理 健康昆明系雄性小白鼠60只，隨機分為4組，即對照組、鉬100組、鉬200組和鉬400組，每組15只，分別飲用由鉬酸鈉配制、含鉬濃度為0、100、200、400 mg/L 去離子水。小鼠常規飼養，自由取食、飲水，染毒時間90 d。

1.2.2 睪丸組織切片制作、勻漿的制備及指標檢測 染毒90 d后，各組取小鼠5只，頸椎脫臼處死；打開腹腔，迅速摘取睪丸，去除外膜及血管，用4 ℃預冷生理鹽水洗凈血液，濾紙吸干水分。睪丸一側用中性甲醛固定，常規制作石蠟切片，HE染色，光鏡檢測；另一側精確稱重，眼科剪剪碎，加冰浴生理鹽水，用玻璃勻漿器制成質量濃度為10%的組織勻漿，冷凍離心機3 000 r/min離心10 min，棄去沉淀，取上清液，置 -20 ℃ 冰箱中保存待測。嚴格按照試劑盒操作規程，測定睪丸組織液中NO含量以及Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活力，以1 h 1 mg蛋白分解ATP酶產生1 μmol的Pi量為1個ATP酶活力單位，即1 μmol/（mg·h）。

1.3 數據處理

數據采用“x±s”表示，利用SPSS 17.0統計軟件，采取單因素方差分析比較組間差異。

2 結果與分析

2.1 鉬對小鼠睪丸組織NO含量及ATP酶活性的影響

由表1可見，小鼠睪丸組織NO含量隨染毒劑量的增加而增加；鉬200組較對照組差異顯著（P<0.01），鉬400組較對照組差異極顯著（P<0.01）；小鼠睪丸組織Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的活力隨染毒劑量的增加，活性逐漸降低；鉬200組及鉬400組Na+-K+-ATP酶活性降低較對照組差異極顯著（P<0.01），鉬200組Ca2+-ATP酶的活力降低較對照組差異顯著（P<0.05），鉬400組Ca2+-ATP酶的活力降低較對照組差異極顯著（P<0.01）。

Na+-K+-ATP酶為細胞膜上跨膜載體蛋白，能將細胞內的Na+泵出細胞外，同時將細胞外的K+泵入細胞內，Na+-K+-ATP 酶不僅能通過水解ATP為生命活動提供能量，還對細胞穩態的維持發揮重要作用。Ca2+-ATP酶通過磷酸化和去磷酸化的變構效應，調控細胞內外的Ca2+濃度，維持細胞內Ca2+的穩態，對維持細胞內外電位平衡及細胞信使的傳遞有重要的生物學意義，還可調控細胞內Mg2+濃度，影響細胞內DNA合成^[4]，從而影響組織細胞物質交換及能量代謝。研究發現，多種重金屬物質如鎘、鉛等可以通過抑制Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的活力來影響動物的生殖功能^[5]。本研究發現，鉬染毒小鼠睪丸組織中的Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活力下降，鉬可抑制雄性小鼠睪丸生精細胞和支持細胞物質交換及能量代謝，引起小鼠睪丸形態結構改變，導致精子生成減少。

NO是機體內的一種生物信號分子，同時還是一氣體類自由基，具有高度的活潑性和極強的氧化反應能力。內源性NO由一氧化氮合酶催化L-精氨酸產生，生理范圍內NO水平對機體是有益的；當NO生成過多，會產生極強的細胞毒作用，導致睪丸組織細胞脂質過氧化損傷^[6]，造成核酸、蛋白、糖類和脂質等細胞成分損傷，從而導致能量代謝受到抑制，三羧酸循環、氧化磷酸化和糖酵解受到干擾，影響精子的正常發生及獲能^[7]。Kai研究發現，過多的自由基攻擊可直接破壞Na+-K+-ATP酶結構，導致Na+-K+-ATP酶活性下降，進一步導致細胞內Na+增多，從而激活細胞膜上的Na+-Ca2+交換蛋白，使細胞內Ca2+增多，Ca2+-ATP酶活性減弱，細胞內鈣超載，干擾線粒體氧化磷酸化反應，ATP生成減少，加重細胞能量耗竭，ATP酶活性進一步降低^[8]。本研究發現，鉬染毒小鼠睪丸中的NO生成增多，并且隨著鉬染毒劑量的增加，睪丸組織NO含量也隨著增多，睪丸組織細胞損傷程度也越顯著，這與文獻報道結果^[9]相一致。另外，高濃度的NO還可以通過cGMP介導作用抑制睪酮分泌^[10]，導致生精功能降低，這也可能是高劑量鉬影響雄性生殖功能的另一個途徑。endprint

綜上所述，鉬對睪丸的細胞毒作用存在NO毒作用機制，并可通過抑制Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的活性影響生殖功能。

參考文獻：

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[10]Valenti S，Cuttica C M，Fazzuoli L，et al. Biphasic effect of nitric oxide on testosterone and cyclic GMP production by purified rat leydig cells cultured in vitro[J]. International Journal of Andrology，1999，22（5）：336-341.endprint

綜上所述，鉬對睪丸的細胞毒作用存在NO毒作用機制，并可通過抑制Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的活性影響生殖功能。

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綜上所述，鉬對睪丸的細胞毒作用存在NO毒作用機制，并可通過抑制Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的活性影響生殖功能。

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