紫斑牡丹雜交授粉后胚珠的形態學觀察

孫銘+高丹丹+鞠志新

摘要：選取性狀優良的紫斑牡丹為母本，與16個芍藥屬品種進行雜交，采用徒手切片法，對其中父本為胡紅、洛陽紅、紅蓮、芍藥的4個雜交組合授粉后的胚珠分期進行形態學觀察，研究了正常胚珠和敗育胚珠的形態學發育過程。結果表明，結種率較高的雜交組合，授粉后胚珠的敗育率較低，大部分胚珠能夠正常發育，胚珠的發育依次經過單核胚囊、二核胚囊、四分體至八核胚囊、合子胚、多游離核原胚、原胚細胞化、棒形胚、心形胚，最終到達子葉形胚；結種率較低的雜交組合，授粉后胚珠的敗育率較高，胚珠內無胚和胚乳，敗育胚珠主要停留在原胚細胞化階段。

關鍵詞：紫斑牡丹；雜交；胚珠；敗育

中圖分類號：S685.110.3 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0169-03

紫斑牡丹（Paeonia suffrutic var. papavercea）屬芍藥科芍藥屬，1987年被列為國家三級保護植物，是牡丹家族中重要的成員，也是中國牡丹品種群的原始種之一。紫斑牡丹具有植株高大、花色艷麗、香味濃郁、抗旱耐寒、病蟲害少等優良特性，是既可觀賞，又能藥用和食用的名貴花卉。它喜冷涼干燥氣候，對低溫及干旱適應性強，特別能適應北方大部分較寒冷的地區，因此適宜推廣和用來做親本培育新品種，但其與其他牡丹品種的雜交親和力不同^[1]。本試驗選取性狀優良的紫斑牡丹作母本，分別與16個芍藥屬品種進行雜交試驗，通過對授粉后的胚珠進行形態學觀察，試圖找到雜交受精障礙發生的時期，以便采取及時的措施來克服，從而提高結實率，進而為今后探索克服雜交不親和性與不育性所要采取的措施提供理論指導，為培育牡丹新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

雜交母本為紫斑牡丹實生苗，雜交父本材料有中原牡丹品種群的趙粉、首案紅、胡紅、妖黃、洛陽紅、二喬6個品種，紫斑牡丹品種群的玉瓣繡球、早熟禾、和平蓮、藍荷、夜光杯、桃花三轉、紅蓮7個品種，江南牡丹鳳丹、混合花粉、芍藥。試驗材料由吉林農業科技學院牡丹基地、吉林市牡丹園、洛陽牡丹園提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉采集、貯藏與生活力的測定

父本的花在露色期采回，在室內摘下花藥，放在干燥、無陽光直射的環境下陰干24 h。花藥開裂后，收集，花粉裝入硫酸紙袋中，袋外注明父本品種名稱、日期，封口保存于冰箱內。在授粉前檢測花粉的活力，將花粉放在配制好的半固體培養基（配制方法：稱 10 g 蔗糖、1 mg 硼酸，0.25 g的瓊脂與 90 ml 蒸餾水放入燒杯中，在 100 ℃水浴中熔化，加水定容至 100 mL，冷卻后備用）上培養，培養條件為22 ℃，24 h光照培養，每個品種設3次重復，OLYMPUS顯微鏡（×40）觀察并拍照，統計萌發率。每個重復統計3個視野，連續測定3 d直至萌發率趨于穩定^[2]。萌發標準為花粉管長度大于等于花粉粒直徑；萌發率=萌發的花粉數/花粉總數×100%。

1.2.2 母本去雄、授粉

在母本花蕾開始變軟時，花藥呈綠或綠黃色時，用手輕輕地剝開花蕾去掉花瓣，然后用鑷子徹底剔去花中的雄蕊。去雄后立即套上亞硫酸紙袋，用曲別針夾住袋口。掛上標簽標明去雄套袋日期。在去雄后2～3 d，待母本雌蕊柱頭分泌黏液而發亮時，即可授粉。授粉于上午10點之前進行，每天授粉1次，連續授粉3 d，確保授粉成功。授粉后立即將紙袋套上，折好封緊。授粉后在其莖稈上套上標簽，用鉛筆在標簽上注明雜交組合、授粉日期等。14 d后柱頭萎蔫，已無受精的可能時，將套袋去除，以免妨礙果實生長^[3]。

1.2.3 胚珠的形態學觀察

以父本為胡紅、洛陽紅、紅蓮、芍藥的4個雜交組合為材料，連續觀察記錄4個組合的胚珠發育情況，以最后1次授粉當天為1 d，分期觀察授粉后1、4、7、15、22、29、36、45、60 d的胚珠外觀，并用徒手切片法，將其切成薄而均勻的片狀，低倍鏡下選取薄且透明，組織結構完整的切片。將選取的切片放在番紅試劑中整染一段時間，將染色后的切片依次經過無水乙醇，無水乙醇和二甲苯的混合液，二甲苯溶液三級透明，然后移入潔凈的載玻片水滴中，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察，拍照^[4]。

1.2.4 結實情況統計及采收

當母本果實心皮變為蟹黃色且微裂時摘下，觀察統計結果數、心皮膨大和結種情況，將種子從心皮里剝出來，去除發育不良的癟種、空種后統計每個雜交組合的結種數，計算結種率^[5-6]。

2 結果與分析

2.1 不同品種花粉的萌發率

從表1看出鳳丹和妖黃的花粉萌發率最高，達到了60%以上，說明花粉具有較高的活性，其次為胡紅、首案紅、芍藥、玉瓣繡球，萌發率40%以上，桃花三轉的萌發率最低，為12%，說明不同品種間的花粉活力不同，在雜交育種授粉時應根據測定的花粉活力指標采取不同的授粉方法，活力低的花粉可采取多次多量的方法來提高結種率。

2.2 胚珠發育的形態

以父本為胡紅、洛陽紅、紅蓮、芍藥的4個雜交組合為材料，分別于授粉后l、4、7、15、22、29、36、45、60 d，剖開子房，觀察胚珠發育情況。

2.2.1 胚珠正常發育的形態學觀察 從表2看出，正常胚珠的發育從授粉后開始逐漸長大，胚和胚乳逐漸形成，最終發育成完整的種子。胚珠內胚的發育依次經過單核胚囊、二核胚囊、四分體至八核胚囊、合子胚、多游離核原胚、原胚細胞化、棒形胚、心形胚、最終到子葉形胚。

2.2.2 胚珠敗育的形態 從表3看出：一部分敗育的胚珠在授粉后第7 d左右開始皺縮，29 d左右完全皺縮；一部分胚珠正常膨大，但內部中空，胚和胚乳在發育過程中退化，敗育的胚珠最終停留在原胚細胞化階段。

2.3 以紫斑牡丹為母本的雜交組合結種率

以紫斑牡丹為母本時，運用常規的授粉方法對母本紫斑牡丹與所選的16個父本品種進行品種間雜交。

從表4看出：以紫斑牡丹實生苗為母本，授粉花數為73朵，共結種551粒，平均結種率達7.54粒/朵。結實率最高的組合為紫斑牡丹實生苗×胡紅，平均結種率高達 15.20粒/朵，最低的組合為紫斑牡丹實生苗×芍藥，為 0粒/朵。結種率高的雜交組合，種子的敗育率較低，大部分胚珠能正常發育完全；結種率低的雜交組合，種子敗育率較高，大部分胚珠在發育過程中早已敗育，表現為種子畸形或內部中空，無胚和胚乳。紫斑牡丹與芍藥的結種率為0，說明它們雜交不親和，存在遠緣雜交障礙。

3 討論

研究結果表明，相較于正常發育的胚珠，一部分敗育的胚珠從第7 d就開始皺縮，胚和胚乳在發育過程中逐漸退化，到29 d左右基本上就完全皺縮了， 還有一部分敗育的胚珠在發育的過程中雖沒有皺縮，但發育的過程中不能形成完整的胚和胚乳，最終停留在原胚細胞化階段。結合雜交結種率可以看出，結種率高的雜交組合，授粉后胚珠敗育率低，大部分胚珠發育完好，而結種率低的雜交組合，授粉后存在較多的胚敗育或無胚形成的情況。

通過對胚珠的形態學觀察及結種率的統計，推測紫斑牡丹與其他品種雜交結實率低的原因可能是受精障礙，絕大多數胚珠都沒有完成受精就很快敗育，極少數胚珠可能受精不正常或受精后發育一段時間敗育，建議在今后的雜交育種中應采取各種措施克服受精障礙，以獲得雜交后代。

參考文獻：

[1]成仿云. 美國牡丹芍藥協會與美國牡丹芍藥的發展[J]. 西北師范大學學報：自然科學版，1997，33（1）：110-115.

[2]何桂梅. 牡丹遠緣雜交育種及其胚培養與體細胞胚發生的研究[D]. 北京：北京林業大學，2006.

[3]成仿云，李嘉玨，陳德忠. 中國野生牡丹自然繁殖特性研究[J]. 園藝學報，1997，24（2）：77-81.

[4]郝 青，劉政安，舒慶艷，等. 中國首例芍藥牡丹遠緣雜交種的發現及鑒定[J]. 園藝學報，2008，35（6）：853-858.

[5]胡適宜，朱 澂. 高等植物受精作用中雄性核和雌性核的融合[J]. 植物學報，1979，21（1）：1-10.

[6]郝 捷，劉 勝. 紫斑牡丹栽培品種小孢子發育過程的細胞遺傳學研究[J]. 生物學雜志，2000，17（3）：16-18.

2.3 以紫斑牡丹為母本的雜交組合結種率

以紫斑牡丹為母本時，運用常規的授粉方法對母本紫斑牡丹與所選的16個父本品種進行品種間雜交。

從表4看出：以紫斑牡丹實生苗為母本，授粉花數為73朵，共結種551粒，平均結種率達7.54粒/朵。結實率最高的組合為紫斑牡丹實生苗×胡紅，平均結種率高達 15.20粒/朵，最低的組合為紫斑牡丹實生苗×芍藥，為 0粒/朵。結種率高的雜交組合，種子的敗育率較低，大部分胚珠能正常發育完全；結種率低的雜交組合，種子敗育率較高，大部分胚珠在發育過程中早已敗育，表現為種子畸形或內部中空，無胚和胚乳。紫斑牡丹與芍藥的結種率為0，說明它們雜交不親和，存在遠緣雜交障礙。

3 討論

研究結果表明，相較于正常發育的胚珠，一部分敗育的胚珠從第7 d就開始皺縮，胚和胚乳在發育過程中逐漸退化，到29 d左右基本上就完全皺縮了， 還有一部分敗育的胚珠在發育的過程中雖沒有皺縮，但發育的過程中不能形成完整的胚和胚乳，最終停留在原胚細胞化階段。結合雜交結種率可以看出，結種率高的雜交組合，授粉后胚珠敗育率低，大部分胚珠發育完好，而結種率低的雜交組合，授粉后存在較多的胚敗育或無胚形成的情況。

通過對胚珠的形態學觀察及結種率的統計，推測紫斑牡丹與其他品種雜交結實率低的原因可能是受精障礙，絕大多數胚珠都沒有完成受精就很快敗育，極少數胚珠可能受精不正?；蚴芫蟀l育一段時間敗育，建議在今后的雜交育種中應采取各種措施克服受精障礙，以獲得雜交后代。

參考文獻：

[1]成仿云. 美國牡丹芍藥協會與美國牡丹芍藥的發展[J]. 西北師范大學學報：自然科學版，1997，33（1）：110-115.

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[3]成仿云，李嘉玨，陳德忠. 中國野生牡丹自然繁殖特性研究[J]. 園藝學報，1997，24（2）：77-81.

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[5]胡適宜，朱 澂. 高等植物受精作用中雄性核和雌性核的融合[J]. 植物學報，1979，21（1）：1-10.

[6]郝 捷，劉 勝. 紫斑牡丹栽培品種小孢子發育過程的細胞遺傳學研究[J]. 生物學雜志，2000，17（3）：16-18.

2.3 以紫斑牡丹為母本的雜交組合結種率

以紫斑牡丹為母本時，運用常規的授粉方法對母本紫斑牡丹與所選的16個父本品種進行品種間雜交。

從表4看出：以紫斑牡丹實生苗為母本，授粉花數為73朵，共結種551粒，平均結種率達7.54粒/朵。結實率最高的組合為紫斑牡丹實生苗×胡紅，平均結種率高達 15.20粒/朵，最低的組合為紫斑牡丹實生苗×芍藥，為 0粒/朵。結種率高的雜交組合，種子的敗育率較低，大部分胚珠能正常發育完全；結種率低的雜交組合，種子敗育率較高，大部分胚珠在發育過程中早已敗育，表現為種子畸形或內部中空，無胚和胚乳。紫斑牡丹與芍藥的結種率為0，說明它們雜交不親和，存在遠緣雜交障礙。

3 討論

研究結果表明，相較于正常發育的胚珠，一部分敗育的胚珠從第7 d就開始皺縮，胚和胚乳在發育過程中逐漸退化，到29 d左右基本上就完全皺縮了， 還有一部分敗育的胚珠在發育的過程中雖沒有皺縮，但發育的過程中不能形成完整的胚和胚乳，最終停留在原胚細胞化階段。結合雜交結種率可以看出，結種率高的雜交組合，授粉后胚珠敗育率低，大部分胚珠發育完好，而結種率低的雜交組合，授粉后存在較多的胚敗育或無胚形成的情況。

通過對胚珠的形態學觀察及結種率的統計，推測紫斑牡丹與其他品種雜交結實率低的原因可能是受精障礙，絕大多數胚珠都沒有完成受精就很快敗育，極少數胚珠可能受精不正?；蚴芫蟀l育一段時間敗育，建議在今后的雜交育種中應采取各種措施克服受精障礙，以獲得雜交后代。

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[5]胡適宜，朱 澂. 高等植物受精作用中雄性核和雌性核的融合[J]. 植物學報，1979，21（1）：1-10.

[6]郝 捷，劉 勝. 紫斑牡丹栽培品種小孢子發育過程的細胞遺傳學研究[J]. 生物學雜志，2000，17（3）：16-18.