草果果腐病拮抗內(nèi)生菌的篩選與初步鑒定

郭建偉+郭娟+劉艷紅+楊建秋+楊麗芬+洪亮+楊建

摘要：采用組織破碎、稀釋涂布法、對峙培養(yǎng)法，分別從草果（Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire）根、莖、葉中分離果腐病鐮刀菌拮抗內(nèi)生菌。結果表明，分別從草果的根、莖、葉分離出內(nèi)生細菌13、6、3株，從根、莖、葉分離內(nèi)生真菌5、1、0株。從草果根、莖、葉分離到的內(nèi)生細菌、內(nèi)生真菌數(shù)量以及草果果腐病鐮刀菌的拮抗內(nèi)生細菌、拮抗內(nèi)生真菌數(shù)量均呈現(xiàn)依次遞減趨勢。草果根部存在葡萄球菌屬、微球菌屬、芽孢桿菌屬3類拮抗內(nèi)生細菌及3株不同屬的內(nèi)生真菌，莖部僅有微球菌屬1類拮抗內(nèi)生細菌。

關鍵詞：鐮刀菌；內(nèi)生真菌；內(nèi)生細菌

中圖分類號：S436.67；Q939.9 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0116-02

草果（Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire）為姜科豆蔻屬多年生常綠叢生草本植物，主要分布在我國貴州、廣西、云南等地，果實性溫、濃香，具有健胃、消食、順氣、祛寒濕等藥效，是上好的烹調(diào)佐料^[1]。草果在云南省南部、東南部、西南部地區(qū)的亞熱帶雨林中廣泛種植，葉斑病、花腐病、果腐病、立枯病等病害日益嚴重，常導致果穗腐爛、脫落，果實腐爛，葉片枯死^[2-4]。內(nèi)生菌是指生活史的某一階段或全部階段生活在健康植物組織和器官內(nèi)的真菌、細菌、放線菌，被感染的宿主植物不表現(xiàn)外在癥狀^[5]。利用內(nèi)生菌的固氮、促生、抗旱、防病等功能，開發(fā)微生物菌肥，可替代或減少農(nóng)藥、化肥的使用，改善農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)，保持植物微生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展^[6]。目前關于利用草果果腐病拮抗內(nèi)生菌研究鮮見報道。本研究探索草果內(nèi)生菌的分離方法并篩選拮抗菌株，旨在為草果的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)提供潛在的生防菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

草果果腐病鐮刀菌（Fusarium sp.）F1、F2均由紅河學院云南省高校農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點實驗室提供。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）、馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）、LB液體培養(yǎng)基。

1.2 內(nèi)生菌分離

1.2.1 樣品采集 從云南省紅河州金屏縣馬鞍底鄉(xiāng)草果種植區(qū)分別采集草果根、莖、葉，置于無菌自封袋內(nèi)帶回實驗室。

1.2.2 內(nèi)生細菌的分離、純化 將根、莖、葉修剪整齊，分別放入75%乙醇中消毒5 min，再放入10%NaClO中分別消毒8、5、2 min，用無菌水反復浸洗2～3次，最后用無菌濾紙吸干表面水分。分別取5 g樣品置于無菌研缽中，加10 mL無菌水研磨，靜置50 s，取30 μL分別涂布在LB、PDA平板上，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)2～3 d，以最后一遍浸洗消毒組織的無菌水涂布上述平板作為對照。待菌落長出后，根據(jù)細菌形態(tài)、顏色、質(zhì)地，反復劃線純化，根據(jù)真菌菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地及菌絲形態(tài)（粗細、氣生菌絲是否發(fā)達）挑取菌絲轉接純化^[7]。

1.3 內(nèi)生菌對果腐病病原菌的拮抗測定

1.3.1 鐮刀菌、內(nèi)生菌的培養(yǎng)

將鐮刀菌、內(nèi)生真菌接在PDA平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)，待菌絲長滿平板后轉4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩⒓兓膬?nèi)生細菌接種于LB培養(yǎng)基上，28 ℃ 160 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，4 ℃ 6 000 r/min離心12 min，取沉淀，以無菌水懸浮并調(diào)整濃度為106 CFU/mL。

1.3.2 拮抗活性測定

用打孔器取直徑為5 mm的病原菌餅于PDA平板中央，用接種環(huán)挑取內(nèi)生細菌懸浮液點接在距平板中央3 cm處的4個角點上，或用打孔器取直徑為5 mm的內(nèi)生真菌點接在距病原菌2～3 cm處的平板右邊，以僅接鐮刀菌的平板作為對照，每處理設3次重復。28 ℃恒溫培養(yǎng)3～ 7 d 后，計算相對抑制率：I=（R0-Ri）/R0×100%。式中：R0代表對照病原菌菌落的擴展半徑，Ri代表對峙培養(yǎng)病原菌菌落的擴展半徑，I代表相對抑制率。

1.4 拮抗菌株的鑒定

用形態(tài)學、生理生化方法初步鑒定內(nèi)生細菌，用形態(tài)學方法初步鑒定內(nèi)生真菌^[8-9]。

2 結果與分析

2.1 草果內(nèi)生菌的分離

利用涂布平板法，根據(jù)菌落的形態(tài)、顏色、質(zhì)地、大小等特征劃線純化，分別從草果的根、莖、葉中分離出內(nèi)生細菌13、6、3株，共計22株。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、大小、質(zhì)地及菌絲形態(tài)的不同，分別從根、莖、葉中分離內(nèi)生真菌5、1、0株，共計6株。從草果根系分離到的內(nèi)生菌數(shù)量及種類遠多于莖、葉。

2.2 內(nèi)生菌對鐮刀菌的拮抗活性測定

采用對峙培養(yǎng)法利用PDA培養(yǎng)基篩選出對草果果腐病鐮刀菌具有一定拮抗作用的內(nèi)生細菌5株，占測試內(nèi)生細菌的22.73%。其中，4株分離自草果根系，1株分離自草果莖。由表1可知，分離自根系的菌株CGGX-09、CGGX-16對草果果腐病有較強的抑制作用。采用對峙培養(yǎng)法利用PDA培養(yǎng)基篩選出拮抗性內(nèi)生真菌3株，均分離自根系，占測試內(nèi)生真菌的50%。CGGZ-02 、CGGZ-03、CGGZ-04對草果果腐病的抑菌率分別為31.8%、90.95%、15.0%，菌株CGGZ-03對草果果腐病抑制作用較強。

2.3 拮抗內(nèi)生菌的鑒定

結合形態(tài)學、生理生化分析對拮抗性內(nèi)生細菌進行鑒定，結果表明：CGGX-09革蘭氏反應陰性，球菌，接觸酶反應陽性，甲基紅反應陰性，淀粉水解反應陰性，可耐受7% NaCl。CGJX-10 革蘭氏反應陰性，球菌，接觸酶反應陽性，甲基紅反應陰性，淀粉水解反應陰性，可耐受7% NaCl。CGGX-11革蘭氏反應陽性，桿菌，接觸酶反應陽性，甲基紅反應陰性，淀粉水解反應陰性，可耐受7% NaCl。CGGX-16革蘭氏反應陽性，桿菌，接觸酶反應陽性，甲基紅反應陰性，淀粉水解反應陰性，可耐受10% NaCl。CGGX-20革蘭氏反應陰性，球菌，接觸酶反應陽性，甲基紅反應陰性，淀粉水解反應陰性，可耐受10% NaCl。參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》^[8]，可以初步確定菌株CGGX-09為葡萄球菌屬，菌株CGJX-10為微球菌屬，菌株CGGX-11為芽孢桿菌屬，菌株CGGX-16為芽孢桿菌屬，菌株CGGX-20為微球菌屬。根據(jù)內(nèi)生真菌的菌落形態(tài)觀察，結合《真菌鑒定手冊》^[9]，初步確定菌株CGGZ-02為子囊菌綱多腔菌目沙卡氏菌科沙卡氏菌屬，菌株 CGGZ-03 為半知菌亞門叢梗孢目青霉屬卡地干酪青霉組，菌株 CGGZ-04 為半知菌類無孢菌群絲核菌屬（表2）。

3 結論與討論

3.1 樣品組織對內(nèi)生菌多樣性的影響

研究表明，內(nèi)生菌廣泛分布于植物的根、莖、葉、花、果實、種子等器官、組織的細胞或細胞間隙中^[10]。石斛內(nèi)生真菌分布及類群組成具有組織差異性，不同地方的樣品內(nèi)生真菌優(yōu)勢種群也具有差異性^[11-12]。本研究從草果根、莖、葉分離到的內(nèi)生細菌、內(nèi)生真菌數(shù)量以及草果果腐病鐮刀菌的拮抗內(nèi)生細菌、拮抗內(nèi)生真菌數(shù)量均呈現(xiàn)依次遞減趨勢。草果根部存在葡萄球菌屬、微球菌屬、芽孢桿菌屬3類拮抗內(nèi)生細菌及3株不同屬的內(nèi)生真菌，莖部僅有微球菌屬1類拮抗內(nèi)生細菌，初步揭示了草果內(nèi)生菌分布及類群存在著組織差異性。根部內(nèi)生菌及拮抗菌株較為豐富或許與果腐病鐮刀菌是土傳病害有關。

3.2 草果內(nèi)生菌對果腐病鐮刀菌的防治

生防菌的田間防效會因物理、化學、微生物種群等因素的影響而降低，因而室內(nèi)篩選的生防菌尚需盆栽試驗進一步驗證^[13]。內(nèi)生真菌CGGZ-03經(jīng)鑒定為青霉屬真菌，該菌為多種土壤的優(yōu)勢真菌屬，且能分泌豐富的抑菌次生代謝物^[14]。張玲琪等從草果病害組織中分離出青霉，但未經(jīng)回接試驗證明為病原菌^[2]。該菌株在探索盆栽試驗及田間試驗前應進行草果接種試驗探明其是否具有致病性。

參考文獻：

[1]唐德英，馬 潔，里 二，等. 我國草果栽培技術研究慨況[J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2009，5（7）：157-162.

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[3]魯海菊，張云霞，劉 衛(wèi)，等. 草果葉斑病防治初步研究[J]. 菌物研究，2007，5（3）：169-170，173.

[4]魯海菊，張云霞，劉 衛(wèi)，等. 草果疫病初步研究[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學學報，2007，22（5）：773-775.

[5]魏寶陽，曹 亮，李順祥，等. 內(nèi)生菌與藥用植物的關系及對次生代謝產(chǎn)物的影響[J]. 中國農(nóng)學通報，2011，27（19）：83-88.

[6]石晶盈，陳維信，劉愛媛. 植物內(nèi)生菌及其防治植物病害的研究進展[J]. 生態(tài)學報，2006，26（7）：2395-2401.

[7]李志強，張 莉，張 穎，等. 綠豆立枯病根際生防細菌的篩選[J]. 河南大學學報：自然科學版，2009，39（1）：68-71.

[8]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，2001.

[9]魏景超. 真菌鑒定手冊[M]. 上海：上海科學技術出版社，1979.

[10]宋素琴，歐提庫爾·瑪合木提，張志東，等. 新疆脹果甘草內(nèi)生菌的分離和鑒定[J]. 微生物學通報，2007，34（5）：867-870.

[11]胡克興，侯曉強，郭順星.鐵皮石斛內(nèi)生真菌分布[J]. 微生物學通報，2010，37（1）：37-42.

[12]洪群艷，董文漢，徐文婷，等. 幾種云南野生石斛內(nèi)生真菌的鑒定及分布[J]. 生物技術進展，2012，2（3）：190-194.

[13]Zou C S，Mo M H，Gu Y Q，et al. Possible contributions of volatile-producing bacteria to soil fungistasis[J]. Soil Biology & Biochemistry，2007，39（9）：2371-2379.

[14]魯海菊，張曉永，全舒舟，等. 從93株土壤真菌中篩選抑制石榴干腐病菌的活性菌株[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2013，41（7）：108-110.

3 結論與討論

3.1 樣品組織對內(nèi)生菌多樣性的影響

研究表明，內(nèi)生菌廣泛分布于植物的根、莖、葉、花、果實、種子等器官、組織的細胞或細胞間隙中^[10]。石斛內(nèi)生真菌分布及類群組成具有組織差異性，不同地方的樣品內(nèi)生真菌優(yōu)勢種群也具有差異性^[11-12]。本研究從草果根、莖、葉分離到的內(nèi)生細菌、內(nèi)生真菌數(shù)量以及草果果腐病鐮刀菌的拮抗內(nèi)生細菌、拮抗內(nèi)生真菌數(shù)量均呈現(xiàn)依次遞減趨勢。草果根部存在葡萄球菌屬、微球菌屬、芽孢桿菌屬3類拮抗內(nèi)生細菌及3株不同屬的內(nèi)生真菌，莖部僅有微球菌屬1類拮抗內(nèi)生細菌，初步揭示了草果內(nèi)生菌分布及類群存在著組織差異性。根部內(nèi)生菌及拮抗菌株較為豐富或許與果腐病鐮刀菌是土傳病害有關。

3.2 草果內(nèi)生菌對果腐病鐮刀菌的防治

生防菌的田間防效會因物理、化學、微生物種群等因素的影響而降低，因而室內(nèi)篩選的生防菌尚需盆栽試驗進一步驗證^[13]。內(nèi)生真菌CGGZ-03經(jīng)鑒定為青霉屬真菌，該菌為多種土壤的優(yōu)勢真菌屬，且能分泌豐富的抑菌次生代謝物^[14]。張玲琪等從草果病害組織中分離出青霉，但未經(jīng)回接試驗證明為病原菌^[2]。該菌株在探索盆栽試驗及田間試驗前應進行草果接種試驗探明其是否具有致病性。

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[14]魯海菊，張曉永，全舒舟，等. 從93株土壤真菌中篩選抑制石榴干腐病菌的活性菌株[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2013，41（7）：108-110.

3 結論與討論

3.1 樣品組織對內(nèi)生菌多樣性的影響

研究表明，內(nèi)生菌廣泛分布于植物的根、莖、葉、花、果實、種子等器官、組織的細胞或細胞間隙中^[10]。石斛內(nèi)生真菌分布及類群組成具有組織差異性，不同地方的樣品內(nèi)生真菌優(yōu)勢種群也具有差異性^[11-12]。本研究從草果根、莖、葉分離到的內(nèi)生細菌、內(nèi)生真菌數(shù)量以及草果果腐病鐮刀菌的拮抗內(nèi)生細菌、拮抗內(nèi)生真菌數(shù)量均呈現(xiàn)依次遞減趨勢。草果根部存在葡萄球菌屬、微球菌屬、芽孢桿菌屬3類拮抗內(nèi)生細菌及3株不同屬的內(nèi)生真菌，莖部僅有微球菌屬1類拮抗內(nèi)生細菌，初步揭示了草果內(nèi)生菌分布及類群存在著組織差異性。根部內(nèi)生菌及拮抗菌株較為豐富或許與果腐病鐮刀菌是土傳病害有關。

3.2 草果內(nèi)生菌對果腐病鐮刀菌的防治

生防菌的田間防效會因物理、化學、微生物種群等因素的影響而降低，因而室內(nèi)篩選的生防菌尚需盆栽試驗進一步驗證^[13]。內(nèi)生真菌CGGZ-03經(jīng)鑒定為青霉屬真菌，該菌為多種土壤的優(yōu)勢真菌屬，且能分泌豐富的抑菌次生代謝物^[14]。張玲琪等從草果病害組織中分離出青霉，但未經(jīng)回接試驗證明為病原菌^[2]。該菌株在探索盆栽試驗及田間試驗前應進行草果接種試驗探明其是否具有致病性。

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[6]石晶盈，陳維信，劉愛媛. 植物內(nèi)生菌及其防治植物病害的研究進展[J]. 生態(tài)學報，2006，26（7）：2395-2401.

[7]李志強，張 莉，張 穎，等. 綠豆立枯病根際生防細菌的篩選[J]. 河南大學學報：自然科學版，2009，39（1）：68-71.

[8]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，2001.

[9]魏景超. 真菌鑒定手冊[M]. 上海：上海科學技術出版社，1979.

[10]宋素琴，歐提庫爾·瑪合木提，張志東，等. 新疆脹果甘草內(nèi)生菌的分離和鑒定[J]. 微生物學通報，2007，34（5）：867-870.

[11]胡克興，侯曉強，郭順星.鐵皮石斛內(nèi)生真菌分布[J]. 微生物學通報，2010，37（1）：37-42.

[12]洪群艷，董文漢，徐文婷，等. 幾種云南野生石斛內(nèi)生真菌的鑒定及分布[J]. 生物技術進展，2012，2（3）：190-194.

[13]Zou C S，Mo M H，Gu Y Q，et al. Possible contributions of volatile-producing bacteria to soil fungistasis[J]. Soil Biology & Biochemistry，2007，39（9）：2371-2379.

[14]魯海菊，張曉永，全舒舟，等. 從93株土壤真菌中篩選抑制石榴干腐病菌的活性菌株[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2013，41（7）：108-110.