核質互作型雄性不育水稻分蘗期超氧化物歧化酶和丙二醛含量變化

李建欣+代西梅+李林玉+黃群策

摘要：為進一步了解水稻雄性不育現象，研究了核質互作型雄性不育水稻不育系451A及保持系451B分蘗期葉片超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）含量的動態變化情況。結果表明，不育系水稻營養生長階段的分蘗期SOD、POD、CAT活性以及MDA含量表現異常，不育系水稻SOD活性高于保持系，不育系水稻CAT活性低于保持系，導致不育系水稻MDA含量較高，這可能引起了水稻能量、物質代謝異常，膜脂過氧化逐漸積累，從而造成了花粉敗育。

關鍵詞：水稻；雄性不育系；分蘗期；超氧化物歧化酶；丙二醛

中圖分類號：S511.03 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0081-02

雄性不育是雄性器官退化、發育不良或花粉敗育，不能行使生殖能力而雌蕊發育正常的現象。雄性不育起源于遺傳性遠緣異質的植物雜交，后代產生了生理、代謝紊亂，致使雄性生殖細胞敗育。植物雄性不育有2種類型：一種為生理上的雄性不育，是由逆境脅迫及各種理化因素造成的，不育性不能傳給后代，育種上不能連續利用；另一種為遺傳上的雄性不育，是受雄性不育基因控制，這種基因一般屬隱性，有重要的利用價值^[1]。核質互作型雄性不育又稱細胞質雄性不育（cytoplasmic male sterility，CMS），屬于遺傳不育。植物育性的表達是由基因控制的生理過程、生化反應、形態構建的最終結果，包括一系列物質代謝、能量代謝，涉及各種復雜的生理生化反應。基因控制酶蛋白的合成，酶又調控代謝反應，多個代謝反應的綜合集中表現便是性狀。因此育性的變化也是酶活性變化引起的結果之一^[2]。植物在代謝過程中產生有氧自由基，遇逆境脅迫時，植物體內大量增生自由基，致使膜脂過氧化嚴重，造成膜結構受損，蛋白質結構被改變，最終對生物體產生傷害。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）是植物抗氧化酶促防御系統中的3個主要酶類。SOD對活性氧的清除反應過程為：2O-2+2H+→H2O2+O2，POD、CAT進一步催化H2O2分解成H2O從而徹底解毒，使植物體內活性氧保持在較低水平，這3種酶協同作用，可減輕自由基對生物體造成的毒害，提高機體抗逆能力。丙二醛（MDA）是膜脂過氧化的產物，它的含量高低可反映細胞膜受損害的程度。前人對水稻生殖生長階段的生理生化反應進行了研究，但是關于水稻營養生長階段的動態研究還比較少。本研究以核質互作型雄性不育水稻為材料，調查了分蘗期水稻葉片中SOD、POD、CAT、MDA含量變化，以探討水稻不育系不育的生理機制，旨在為進一步豐富水稻雄性不育理論提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

核質互作型雄性不育水稻451A及保持系451B均由河南省新鄉市農業科學院秋糧研究所提供。供試水稻種植于河南省新鄉市農業科學院內，采用常規管理。水稻分蘗初期到后期每隔5 d取1次材料。取每株主莖上面第1張全展葉，每次取3張葉中部，放冰上帶回實驗室統一進行酶活測定。

1.2 粗酶液提取和酶活性測定

稱取葉片樣品0.5 g置于預冷的研缽中，加入1 mL預冷的磷酸緩沖液（pH值為7.8），冰浴研磨成漿，加緩沖液使終體積為5 mL，于11 000×g、4 ℃下離心15 min，上清液即為SOD、POD、CAT粗提液，3次重復^[3-4]。采用NBT（氮藍四唑）光還原法測定葉片SOD活性。反應液為3 mL NBT、1 mL酶液，對照液為3 mL NBT、1 mL磷酸緩沖液（pH值為7.8），25～30 ℃、4 000 lx于日光下反應20 min，調零液遮光，560 nm 下測定吸光度值。SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為1個酶活性單位來表示。采用愈創木酚法測定POD活性。反應液為2.7 mL磷酸緩沖液、100 μL愈創木酚、100 μL H2O2、100 μL酶液，470 nm下測定吸光度值，每隔 1 min 讀數1次，共測4 min，磷酸緩沖液調零。采用紫外吸收法測定CAT活性。反應液為2.8 mL磷酸緩沖液（pH值為7.8）、100 μL H2O2、100 μL酶液，240 nm下測定吸光度值，每隔1 min讀數1次，共測4 min，磷酸緩沖液調零。MDA提取與活性測定：稱取葉片樣品1 g置于預冷的研缽中，加入2 mL 10% TCA、少量石英砂，研磨至勻漿，再加8 mL TCA進一步研磨勻漿，4 000 r/min離心10 min，上清液為樣品提取液。采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量。吸取離心的上清液 2 mL，加入2 mL 0.6% TBA溶液，混勻于沸水浴上反應 15 min，迅速冷卻后再離心。取上清液測定532、450 nm波長下的吸光度值，蒸餾水調零。

2 結果與分析

2.1 MDA含量的變化

由表1可見，分蘗期前期不育系水稻葉片中MDA含量極顯著高于保持系，分蘗期后期不育系仍然顯著高于保持系，但是沒有分蘗前期顯著。總體來說，不育系由分蘗前期到分蘗后期有下降的趨勢，保持系變化沒有不育系大。

2.2 SOD活性的變化

由表1可見，分蘗期前3個時間點不育系及保持系水稻葉片SOD活性均下降，分蘗期后3個時間點不育系及保持系水稻葉片SOD活性均上升。每個時期不育系水稻葉片SOD活性均高于保持系。

2.3 CAT活性的變化

由表1可見，從分蘗期開始到最后，不育系水稻葉片CAT活性有波動但是整體變化不大，保持系水稻葉片CAT活性下降趨勢明顯，總體而言，不育系水稻分蘗期不育系葉片CAT活性略低于保持系。

2.4 POD活性的變化

由表1可見，分蘗期前2個時間點不育系及保持系水稻葉片POD活性均下降，分蘗期后4個時間點不育系及保持系后3個時間點水稻葉片POD活性均上升。從總體趨勢來看，不育系水稻葉片POD活性高于保持系。

3 結論與討論

酶是生物體內的一種特殊的催化刑，由活的生物體合成。酶的活性取決于其蛋白質結構的完整性，任何破壞酶蛋白的因素都能導致酶活性喪失。酶有調控代謝反應的功能，正是由于酶、代謝、生理功能之間的相互關系，使得酶活性變化與育性變化有著密切的關系。植物體內酶的種類、存在量的多少、酶的方向都會直接影響植株生長發育、可育與不育等特性。

植物生長過程中，不斷吸收H2O及CO2進行光合作用，生產有機物質并放出O2，氧在自身還原過程中形成陰離子自由基、羥自由基的活性氧。在光合作用中，植物不可避免地要經受強光、高溫環境，光激發產生的多余能量在光合器中形成單線態氧[5～8]。在光呼吸等代謝過程中，也會有許多H2O2產生，這些H2O2可以通過Habcr-Weiss反應產生毒性更強的OH·自由基。OH·可引發脂質尤其是膜不飽和脂的過氧化，損害生物膜結構，改變蛋白質結構，損傷DNA等生物大分子的結構與功能等。在生物進化過程中，生物也形成了抵抗活性氧傷害的防御系統。SOD是植物體內解除O-2毒害作用的關鍵性酶。CAT、POD則將H2O2通過Habcr-Weiss反應進一步分解而徹底解毒。

以往學者們對于不育水稻抗氧化酶促防御系統幾種關鍵指標的研究結果不盡相同。陳賢豐等以PTGMS不育系農墾58S和w6154S為材料研究發現，單核早期、單核晚期、二核及三核期的不育花藥2種酶在每小穗花藥中的總活性普遍低于其可育花藥^[9]。張明永等比較了CMS水稻不育系珍汕97A及其同核異質保持系珍汕97B，結果表明，與可育三核期花藥相比，不育三核期2種酶活性較低^[10]。梅啟明等研究發現，從穗發育雌雄蕊原基分化期到三核期，不育系農墾58S幼穗或花藥中SOD活性明顯比其可育狀態下的高^[11]。鄒國林等研究發現，穗分化第2次枝梗原基分化期至花粉母細胞形成期，農墾58S葉片SOD比活力高于農墾58，同一品種，長日SOD活性高于短日，農墾58S 葉片CAT比活力變化較顯著，但無規律^[12]。

本研究表明，分蘗期不育系水稻SOD活性比保持系高，推測不育系受到了更強的H2O2傷害，在此時期不育系水稻CAT活性反而遠遠小于保持系，由此可推測不育系有更多的OH·自由基沒有被清除，導致MDA含量增大。分蘗期不育系水稻SOD活性始終高于保持系也從側面證明了不育系受到比保持系更多的H2O2傷害。不育系水稻CAT的酶活性比保持系少，由此可推測在此過程中不育系受OH·自由基的損害作用大，證明不育系一直有較多的脂質尤其是膜不飽和脂過氧化。前人發現，細胞質雄性不育水稻的花粉敗育大多數發生在減數分裂期到二核期，分蘗期要遠遠早于花粉敗育時期。根據MDA、SOD、POD、CAT一系列變化結果說明了水稻核質互作型雄性不育花粉敗育是一個逐漸積累的、由量變到質變的過程，而不是一個“躍遷”的過程，推測可能從分蘗期甚至更早的發育時期花藥的酶促系統已出現了異常，最后發育至花粉敗育時期。本試驗中，不育系水稻營養生長階段的分蘗期SOD、POD、CAT活性以及MDA含量表現異常，不育系水稻SOD活性高于保持系，不育系水稻CAT活性低于保持系，導致不育系水稻MDA含量較高，這可能引起了水稻能量、物質代謝異常，膜脂過氧化逐漸積累，從而造成了花粉敗育。

參考文獻：

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