紅平菇HP1漆酶基因及啟動子克隆和序列分析

鄭苗苗+邵淑麗+張令昻+焦戰(zhàn)戰(zhàn)

摘要：以優(yōu)化后的漆酶培養(yǎng)基為基礎，將RT-PCR、RACE技術相結合，從紅平菇菌株中獲得漆酶基因cDNA全長及Genomic DNA全長序列，Genomic DNA大小為2 344 bp。通過對漆酶基因cDNA全長和Genomic DNA全長序列的比較，結果顯示該基因包含13個外顯子和12個內含子。基因cDNA全長為1 746 bp，其中包含1個完整的ORF，長度為1 590 bp，編碼529個氨基酸。序列在氨基酸水平上與桃紅側耳Pleurotus salmoneostramineus的氨基酸序列具有較高的同源性，相似性達97%，與齒耳菌Steccherinum murashkinskyi漆酶氨基酸序列相似性達到72%。通過SEFA-PCR的方法，擴增得到漆酶基因起始密碼子上游長1 126 bp的啟動子序列。分析表明，該啟動子區(qū)域上除分布有TATA-box、CAAT-box、AP2等基本的轉錄起始元件外，還存在多個潛在的順式作用元件序列位點，包括4個MRE元件、2個CreA熱擊元件、2個STRE元件、1個NIT2元件、1個HSEs元件、1個XRE異生物質反應元件、4個氮因子結合位點等。不同外源誘導物可以調節(jié)紅平菇HP1漆酶基因的表達。

關鍵詞：紅平菇；漆酶基因；啟動子克隆；轉錄調控

中圖分類號：S646.1+40.1 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0021-05

漆酶（laccase）是一種含銅的多酚氧化酶，屬于氧化酶的藍銅家族。漆酶含有4個銅原子，分別位于3個不同結合位點，并且高度保守^[1]。1883年吉田在漆樹中發(fā)現漆酶，1893年Laborde在真菌中發(fā)現漆酶。目前證實漆酶普遍存在于細菌、真菌、植物、昆蟲中^[2]。其中真菌中的白腐菌是最重要的漆酶生產菌。近年來，漆酶是醫(yī)學、化學、生物學、環(huán)境科學等領域的研究熱點^[3]。目前對漆酶生理生化的研究比較明確，已經研究到分子水平并深入基因工程階段，已經克隆許多漆酶基因cDNA及Genomic DNA全長序列，并對其序列進行了核苷酸分析^[4]。真菌漆酶存在很多同工酶基因，由于菌株生長環(huán)境和生理狀態(tài)不同，其表達量也有所不同^[5]。研究表明，真菌漆酶的分泌受金屬離子、營養(yǎng)元素及芳香化合物影響，這些因素是在轉錄水平誘導漆酶上調表達^[6]。由起始密碼子上游的啟動子及相應順式作用元件的作用，轉錄水平的表達量增加。因此，研究真菌漆酶基因上游的啟動子結構及功能對于提高漆酶蛋白的表達產量非常重要。本研究從紅平菇HP1中提取總DNA，利用SEFA-PCR技術克隆了漆酶基因的啟動子序列并對其結構進行分析，以期為進一步了解漆酶基因的表達調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

紅平菇HP1 Pleurotus djamor采集于涼水國家自然保護區(qū)，由齊齊哈爾大學微生物實驗室保存。DNAquick_快捷型植物基因組DNA提取系統、DNAquick Plant System均購自TIANGEN公司；SMART RACE cDNA擴增試劑盒（Clontech）；E.Z.N.A真菌RNA提取試劑盒（OMEGA）；E.Z.N.A凝膠回收試劑盒（OMEGA）；兩步法RT-PCR試劑盒、Genome Walking Kit試劑盒、3′RACE試劑盒均購自TaKaRa公司；E.coli JM109感受態(tài)細胞購自TaKaRa公司；pMD20-T Vector、LA Taq DNA聚合酶（Promega）；其余試劑為進口或國產分析純。

1.2 基因組DNA和總RNA的提取

以陳軍等報道的優(yōu)化后的漆酶培養(yǎng)基^[7]培養(yǎng)紅平菇HP1。提取紅平菇HP1基因組DNA和總RNA，用核酸檢測儀測定產物純度，通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗完整性。

1.3 cDNA核心片段克隆

合成cDNA第1鏈參照兩步法RT-PCR試劑盒使用說明進行。在GenBank中選取20條漆酶基因全長的氨基酸序列，根據比對結果查找出同源序列保守區(qū)，從而設計1對簡并引物（表1），PCR反應體系30 μL，含10×PCR buffer 3 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 1μL，5 U/μL TaKaRa Ex TaqTM HS 0.5 μL，引物Lcc1-RT1和Lcc1-RT2各 1 μL，cDNA 2 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 3 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。取5 μL擴增產物用 12 g/L 瓊脂糖凝膠電泳鑒定（以下檢測方法同）。

1.4 漆酶cDNA3′/5′末端的RACE-PCR擴增

參照3′RACE試劑盒和SMART RACE cDNA擴增試劑盒使用說明合成cDNA，根據漆酶cDNA基因片段序列，設計3′/5′RACE特異性引物，獲得其3′/5′末端序列（表1），cDNA 3′末端套式PCR反應體系25 μL，第1次PCR反應含10×LA PCR buffer Ⅱ（Mg2+Free）2 μL，25 mmol/L MgCl2 1 μL，1×cDNA Dilution buffer Ⅱ 1 μL，10 μmol/L 3′RACE Outer Primer 1 μL，5 U/μL TaKaRa LA Taq

15 min。第2次PCR反應含10×LA PCR buffer Ⅱ（Mg2+Free）2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 4 μL，10 μmol/L Gene Specific Inner Primer 1 μL，10 μmol/L 3′ RACE Inner Primer 1 μL，5 U/μL TaKaRa LA Taq 0.25 μL，第1次 PCR產物 0.5 μL。反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 15 min。cDNA5′末端套式PCR反應體系25 μL，10×Advantage2 PCR buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 0.5 μL，50×Advantage2 polymerase Mix 0.5 μL，5′ RACE-Ready cDNA 1.5 μL，10 μmol/L GSP1 0.5 μL，UPM（10×）2.5 μL。反應條件同3′ RACE。

1.5 漆酶cDNA全長及漆酶Genomic DNA全長的擴增

根據cDNA 3′/5′末端核苷酸序列結果，分別在其3′和5′末端設計特異性引物，用于擴增漆酶cDNA全長序列（表1）。同時以基因組DNA為模板，擴增漆酶基因組全長。cDNA全長PCR反應體系50 μL，含5×Prime STARTM buffer（Mg2+ plus） 10 μL，10 mmol/L dNTP Mixture 4 μL，2.5 U/μL Prime STARTM HS DNA Polymerase 0.5 μL，引物Lcc1-S1和 Lcc1-S2 各1 μL，反轉錄cDNA 5 μL。Genomic DNA全長PCR反應體系及反應條件同“1.3”節(jié)。

1.6 SEFA-PCR法克隆漆酶基因的啟動子序列

根據已獲得的漆酶Genomic DNA全長序列，設計5′端啟動子特異性引物，分別為Lcc1-SP1、Lcc1-SP2、Lcc1-SP3，以基因組DNA為模板進行3輪PCR擴增，獲得漆酶基因5′端啟動子序列（表1）。

1.7 漆酶基因結構及啟動子結構分析

將上述得到的漆酶全長基因cDNA和基因組全長以及5′端啟動子序列經過膠回收試劑盒純化后，進行T載體克隆，并送交北京英俊公司測序。運用生物信息學技術對獲得的漆酶全長基因cDNA和基因組以及5′端啟動子序列進行同源性比較及結構特點分析。

2 結果與分析

2.1 總RNA檢測

提取紅平菇菌絲體總RNA后，經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明，28S rRNA、18S rRNA條帶較清晰，且2條帶比值接近于2 ∶1，證明總RNA較完整。經核酸檢測儀檢測，280/260、260/230分別為2.01、2.57，說明純度較高。所提取總RNA可以用于后續(xù)試驗（圖1）。

2.2 紅平菇HP1漆酶基因cDNA全長的克隆與序列分析

根據真菌漆酶高度保守Cu-bind結構域Ⅰ、Ⅳ的氨基酸序列，設計1對簡并引物并擴增漆酶基因cDNA片段，得到1條約1 000 bp大小條帶，將其進行大腸桿菌轉化并測序，測序結果為1 021 bp，進行Blastx比對后證明是漆酶基因（圖2）。根據已知的漆酶cDNA片段，設計3′端特異性的正向引物：3′RACE GSP （outer）和3′RACE NGSP （inner），以反轉錄的 cDNA 第1條鏈為模板，擴增3′ cDNA末端，獲得約750 bp大小條帶，進行測序后漆酶基因片段為742 bp，其3′末端有典型的PolyA尾巴，并且具有加尾信號（AATAAA）（圖3、圖4）。根據已知的漆酶cDNA片段設計5′端特異性反向互補引物：5′RACE GSP，以反轉錄液為模板，擴增5′ cDNA末端，獲得約 750 bp 大小條帶，進行測序后基因片段為732 bp，5′端有一典型UTR區(qū)（1～66 bp），編碼區(qū)長度為666 bp，該基因片段與RT-PCR擴增的基因片段有重復區(qū)域，進行Blastx比對后證明是漆酶基因（圖5）。

將RT-PCR獲得的漆酶基因片段與3′/5′RACE獲得的漆酶基因片段進行剪切拼接，得到cDNA基因全長為 1 746 bp，命名為Pd-lac1。漆酶具有真核生物基因的一般特征，在其5′端有1個UTR區(qū)，長度為66 bp；3′端具有PolyA尾巴和加尾信號（AATAAA）。通過NCBI的ORF Finder檢測到1條長1 590 bp的完整開放式閱讀框，其編碼529個氨基酸，預測蛋白分子質量為55.52 ku，限制性酶切位點有78個，等電點pI約為4.72。應用RPS-Blast軟件進行Cu-bind結構域分析表明，該蛋白有3個Cu-bind結構域，即pfam07732、pfam07731、pfam00394，其中pfam07732、pfam07731是多銅氧化酶中與次級代謝物運輸、分解代謝和生物合成相關的結構域；pfam00394是Cu離子保守結構域。利用SignalP V2.0軟件分析位于氨基酸序列N端具有真核基因的信號肽序列（1～19aa），剪切位點為AHA-AI。利用Scanprosite軟件分析得出，在漆酶基因編碼的氨基酸序列中含有3個N-糖基化位點（N-X-S/T），天冬酰胺殘基分別位于序列中的第216、311、444處，它們是潛在的糖基化位點。將漆酶編碼的氨基酸序列與已知的蛋白序列進行Blastp比對后發(fā)現，它與桃紅側耳Pleurotus salmoneostramineus的氨基酸序列具有較高的同源性，相似性達97%，與齒耳菌Steccherinum murashkinskyi漆酶氨基酸序列相似性達到72%。

2.3 漆酶Genomic DNA全長的克隆與結構分析

根據漆酶全長cDNA序列設計1對特異性全長引物，以提取總DNA為模板通過全長PCR擴增得到該漆酶Genomic DNA的全長序列，全長為2 258 bp，命名為Pd-lac1（圖6）。

利用NCBI網站的Align Sequences Nucleotide BLAST對漆酶基因cDNA全長和基因組DNA全長序列進行分析，在所克隆的漆酶基因組DNA中包含13個外顯子和12個內含子。內含子長度分別為56、48、53、51、55、66、51、51、58、68、51、56 bp，是典型的真菌內含子長度（49～85 bp）。每個內含子剪切位點序列為5′GT…AG-3′（圖7）。

2.4 漆酶基因啟動子的獲得與轉錄調控元件分析

根據漆酶Genomic DNA全長序列信息，參照Liu的方法^[8]，靠近5′端設計3條反向引物Lcc1-SP1、Lcc1-SP2、Lcc1-SP3，以紅平菇HP1基因組DNA為模板對該基因上游片段進行hiTAIL_PCR擴增。3輪反應后，引物Lcc1-SP1、Lcc1-SP2、Lcc1-SP3獲得了較長的PCR產物（圖8）。對第3輪PCR中的Lcc1-SP3、AP3引物產物進行回收測序，獲得了總長度1 500 bp的序列信息，分析發(fā)現該序列包括漆酶基因5′末端及其上游。

利用Biological Services網站的Sequence Analysis對克隆得到的Pd-lac啟動子序列進行分析。在Pd-lac啟動子序列中，具有真核生物典型的啟動子基本轉錄調控元件，Pd-lac的啟動子序列中存在許多潛在的外源誘導物響應結合元件，1個CAAT框，位于第-105位；2個熱擊元件（CreA）（SYGGRG），分別位于-78、-396位；2個AP2元件，分別位于第-164、-566位；1個潛在的熱擊響應元件（HSEs）（TCNNGAAN），位于第-660位；2個潛在的壓力響應元件（STRE）（CCCCT/AGGGG），分別位于第-157、-866位；4個金屬應答元件（MRE）（TGCRCNG），分別位于第-381、-466、-803、-928位；1個異生物質反應元件（XRE）（CACGCW），位于第-687位；以及 4個氮因子結合位點（GATA）或其互補序列（TATC），分別位于第-299、-356、-708、-983位；1個NIT2元件，位于第-418位；1個熱擊元件（CreA）（SYGGRG），位于-396位^[9-10]（圖7）。

2.5 紅平菇HP1漆酶基因的系統進化分析

從150個菌株中選取34個相關性菌株，與Pleurotus djamor按照UPGMA聚類法進行系統進化樹分析。從圖9可以看出，35個菌株分為3大類群，其中1類是16個菌株聚成第1個大類群，為多孔菌（Polyporales）；2類是16個菌株聚成第2個大類群，為傘菌（Agaricales）；3類是3個菌株聚成第3個大類群，為子囊菌（Ascomycota）。紅平菇漆酶cDNA基因屬于傘菌，與Pleurotus salmoneostramineus遺傳距離最近，同源性為97%。從系統進化樹可以看出，同一菌株漆酶cDNA基因的同工酶遺傳距離也具有差異，如Lenzites gibbosa等。

3 結論與討論

紅平菇漆酶5′端調控區(qū)域具有真核生物典型的啟動子轉錄元件，CAAT-box、TATA-box、GC-box還具有金屬離子效應位點（MRE），MRE對金屬硫蛋白基因響應重金屬離子的誘導起著至關重要的作用。另外，還分布有2個潛在的壓力響應元件（STRE）和1個潛在的熱激響應元件（HSEs），HSEs通過感受外界熱刺激，進而激活金屬硫蛋白基因的轉錄，因而STRE、HSEs可能會共同響應高濃度Cu2+的壓力而激活紅平菇漆酶基因的轉錄^[2]。紅平菇漆酶5′啟動子的克隆，為漆酶表達調控機制的研究奠定了基礎。紅平菇漆酶5′啟動子屬于可誘導型啟動子，這為構建紅平菇誘導型表達載體提供了理論基礎。

1個漆酶cDNA全長基因和基因組DNA全長序列，這對于今后研究漆酶基因的同源表達、異源表達及蛋白質的純化奠定了基礎。利用SEFA-PCR技術在紅平菇菌株中克隆1個漆酶5′啟動子序列，這對于今后研究紅平菇漆酶的表達調控具有十分重要的意義。

參考文獻：

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[4]Soden D M，Dobson A. Differential regulation of laccase gene expression in Pleurotus sajorcaju[J]. Microbiology，2008，147（8）：1755-1763.

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[8]Liu Y G，Chen Y L. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences[J]. Biotechniques，2007，43（5）：649-650.

[9]Treger J M，Magee T R，Mcentee K. Functional analysis of the stress response element and its role in the multistress response of Saccharomyces cerevisiae[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，1998，243（1）：13-19.

[10]Strauss J，Horvath H K，Abdallah B M，et al. The function of CreA，the carbon catabolite repressor of Aspergillus nidulans，is regulated at the transcriptiosl and post-transcriptional level[J]. Molecular Microbiology，1999，32（1）：169-178.

利用Biological Services網站的Sequence Analysis對克隆得到的Pd-lac啟動子序列進行分析。在Pd-lac啟動子序列中，具有真核生物典型的啟動子基本轉錄調控元件，Pd-lac的啟動子序列中存在許多潛在的外源誘導物響應結合元件，1個CAAT框，位于第-105位；2個熱擊元件（CreA）（SYGGRG），分別位于-78、-396位；2個AP2元件，分別位于第-164、-566位；1個潛在的熱擊響應元件（HSEs）（TCNNGAAN），位于第-660位；2個潛在的壓力響應元件（STRE）（CCCCT/AGGGG），分別位于第-157、-866位；4個金屬應答元件（MRE）（TGCRCNG），分別位于第-381、-466、-803、-928位；1個異生物質反應元件（XRE）（CACGCW），位于第-687位；以及 4個氮因子結合位點（GATA）或其互補序列（TATC），分別位于第-299、-356、-708、-983位；1個NIT2元件，位于第-418位；1個熱擊元件（CreA）（SYGGRG），位于-396位^[9-10]（圖7）。

2.5 紅平菇HP1漆酶基因的系統進化分析

從150個菌株中選取34個相關性菌株，與Pleurotus djamor按照UPGMA聚類法進行系統進化樹分析。從圖9可以看出，35個菌株分為3大類群，其中1類是16個菌株聚成第1個大類群，為多孔菌（Polyporales）；2類是16個菌株聚成第2個大類群，為傘菌（Agaricales）；3類是3個菌株聚成第3個大類群，為子囊菌（Ascomycota）。紅平菇漆酶cDNA基因屬于傘菌，與Pleurotus salmoneostramineus遺傳距離最近，同源性為97%。從系統進化樹可以看出，同一菌株漆酶cDNA基因的同工酶遺傳距離也具有差異，如Lenzites gibbosa等。

3 結論與討論

紅平菇漆酶5′端調控區(qū)域具有真核生物典型的啟動子轉錄元件，CAAT-box、TATA-box、GC-box還具有金屬離子效應位點（MRE），MRE對金屬硫蛋白基因響應重金屬離子的誘導起著至關重要的作用。另外，還分布有2個潛在的壓力響應元件（STRE）和1個潛在的熱激響應元件（HSEs），HSEs通過感受外界熱刺激，進而激活金屬硫蛋白基因的轉錄，因而STRE、HSEs可能會共同響應高濃度Cu2+的壓力而激活紅平菇漆酶基因的轉錄^[2]。紅平菇漆酶5′啟動子的克隆，為漆酶表達調控機制的研究奠定了基礎。紅平菇漆酶5′啟動子屬于可誘導型啟動子，這為構建紅平菇誘導型表達載體提供了理論基礎。

1個漆酶cDNA全長基因和基因組DNA全長序列，這對于今后研究漆酶基因的同源表達、異源表達及蛋白質的純化奠定了基礎。利用SEFA-PCR技術在紅平菇菌株中克隆1個漆酶5′啟動子序列，這對于今后研究紅平菇漆酶的表達調控具有十分重要的意義。

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利用Biological Services網站的Sequence Analysis對克隆得到的Pd-lac啟動子序列進行分析。在Pd-lac啟動子序列中，具有真核生物典型的啟動子基本轉錄調控元件，Pd-lac的啟動子序列中存在許多潛在的外源誘導物響應結合元件，1個CAAT框，位于第-105位；2個熱擊元件（CreA）（SYGGRG），分別位于-78、-396位；2個AP2元件，分別位于第-164、-566位；1個潛在的熱擊響應元件（HSEs）（TCNNGAAN），位于第-660位；2個潛在的壓力響應元件（STRE）（CCCCT/AGGGG），分別位于第-157、-866位；4個金屬應答元件（MRE）（TGCRCNG），分別位于第-381、-466、-803、-928位；1個異生物質反應元件（XRE）（CACGCW），位于第-687位；以及 4個氮因子結合位點（GATA）或其互補序列（TATC），分別位于第-299、-356、-708、-983位；1個NIT2元件，位于第-418位；1個熱擊元件（CreA）（SYGGRG），位于-396位^[9-10]（圖7）。

2.5 紅平菇HP1漆酶基因的系統進化分析

從150個菌株中選取34個相關性菌株，與Pleurotus djamor按照UPGMA聚類法進行系統進化樹分析。從圖9可以看出，35個菌株分為3大類群，其中1類是16個菌株聚成第1個大類群，為多孔菌（Polyporales）；2類是16個菌株聚成第2個大類群，為傘菌（Agaricales）；3類是3個菌株聚成第3個大類群，為子囊菌（Ascomycota）。紅平菇漆酶cDNA基因屬于傘菌，與Pleurotus salmoneostramineus遺傳距離最近，同源性為97%。從系統進化樹可以看出，同一菌株漆酶cDNA基因的同工酶遺傳距離也具有差異，如Lenzites gibbosa等。

3 結論與討論

紅平菇漆酶5′端調控區(qū)域具有真核生物典型的啟動子轉錄元件，CAAT-box、TATA-box、GC-box還具有金屬離子效應位點（MRE），MRE對金屬硫蛋白基因響應重金屬離子的誘導起著至關重要的作用。另外，還分布有2個潛在的壓力響應元件（STRE）和1個潛在的熱激響應元件（HSEs），HSEs通過感受外界熱刺激，進而激活金屬硫蛋白基因的轉錄，因而STRE、HSEs可能會共同響應高濃度Cu2+的壓力而激活紅平菇漆酶基因的轉錄^[2]。紅平菇漆酶5′啟動子的克隆，為漆酶表達調控機制的研究奠定了基礎。紅平菇漆酶5′啟動子屬于可誘導型啟動子，這為構建紅平菇誘導型表達載體提供了理論基礎。

1個漆酶cDNA全長基因和基因組DNA全長序列，這對于今后研究漆酶基因的同源表達、異源表達及蛋白質的純化奠定了基礎。利用SEFA-PCR技術在紅平菇菌株中克隆1個漆酶5′啟動子序列，這對于今后研究紅平菇漆酶的表達調控具有十分重要的意義。

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