植物莖尖分生組織中的干細胞調控機制研究進展

2014-10-23 05:05:33陳菊移王鵬凱陳金慧施季森

江蘇農業科學 2014年8期

陳菊移+王鵬凱+陳金慧+施季森

摘要：莖尖分生組織干細胞是植物地上部分生長發育的基礎。復雜的基因調控網絡和信號傳導途徑使干細胞維持著細胞分裂和分化的平衡。對擬南芥的研究顯示，WUS/CLV3反饋抑制調節機制在干細胞基因調控網絡中發揮著重要作用，且在植物中具有一定保守性；大量轉錄因子和染色體重塑因子在轉錄水平通過調控WUS從而對干細胞活動進行調節；植物生長調節物質也參與調控莖尖分生組織的生長活動，主要通過KNOX基因家族發揮作用。莖尖分生組織的分子調控網絡中存在大量反饋抑制調節途徑，這種調節形式反映了植物體的動態調節能力和平衡維持機制。

關鍵詞：莖尖分生組織；干細胞；WUS/CLV3；反饋調節

中圖分類號：Q942.6 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0011-04

植物莖尖分生組織（shoot apical meristem，SAM）是植物地上部分生長發育的基礎，其中包含的干細胞（SC）通過分裂（進行自身更新并維持一定的細胞數量）和分化（指導一部分細胞輸出分生組織并發育成各種器官）形成了植物地上部分的各個器官。這2種細胞行為使干細胞和分化細胞在數量上保持動態平衡^[1]，保證了植物生長發育過程的可塑性。SAM干細胞區是一個相對獨立的結構，其中的細胞保持未分化的狀態并接受來自臨近細胞的信號。在基因調控和細胞信號的影響下，干細胞一部分進行分裂保持干細胞數量，而另一部分移出該干細胞區域進行分化。分子遺傳學、分子生物學和模式植物擬南芥研究的不斷深入使SAM干細胞基因調控途徑逐漸清晰。研究發現莖尖分生組織中心標記基因WUSCHEL（WUS）和干細胞標記基因CLVATA3（CLV3）^[2]之間的反饋調節機制在分生組織干細胞區確定和維持方面起決定性作用。大多數對植物地上部分生長發揮作用的基因都是通過直接或間接影響WUS/CLV3反饋抑制途徑發揮作用。

[WTHZ]1 SAM結構

植物SAM大約含有500個細胞，這些細胞可分為不同的區域和細胞層。SAM穹頂狀結構自上而下的3層細胞（圖1）稱為L1、L2、L3層細胞：L1層細胞發育成表皮；L2層細胞發育成葉肉；L3層細胞形成葉和莖的內部組織^[3-4]。大多數雙子葉植物SAM中有L1和L2層，大多數單子葉植物SAM中只有L1層細胞^[5]。中心區（含有干細胞和組織中心）和周邊區（分化側生器官）在L1至L3細胞層上橫向排列^[5]，而肋狀區（為莖生長提供細胞）則位于組織中心下方（圖1）。中心區細胞數量穩定且分裂速度緩慢，擬南芥CLV3表達分析結果顯示擬南芥中心區大約含有35個干細胞^[6-7]。周邊區可以進一步分為外周邊區和內周邊區。內周邊區細胞可通過脫分化恢復到干細胞狀態，外周邊區細胞一旦進入分化途徑后無法完成脫分化。與中心區不同，周邊區細胞分裂迅速，可為器官原基的形成提供大量細胞，保證植物正常生長。

2 擬南芥SAM組織中心標記基因WUS及其調控基因

擬南芥SAM中大約有10個細胞表達WUS基因，這些細胞位于中心區L3層和更下層，組成的區域稱為組織中心（圖1）。WUS編碼1個轉錄因子，WUS功能喪失可使干細胞在形成器官原基的過程中消失，SAM活動過早停止^[8]；WUS過表達會形成過多的干細胞，因此擬南芥SAM中WUS的表達可以維持干細胞數目，保證干細胞區域細胞分裂與分化之間的平衡。現有研究結果已經證明WUS基因表達產生的信號經過運輸進入干細胞中發揮作用^[9]。

WUS的表達受到眾多轉錄因子、染色質重塑因子的調控（包括正調控和負調控），這些因子在維持WUS持續表達的同時也將其表達區域限制在組織中心。目前大多數調控因子對WUS的調控機制和途徑仍不清晰，但已發現WUS啟動子中存在能夠保證WUS準確表達的序列^[10]，說明WUS表達調控過程中可能存在轉錄激活復合體，該復合體能夠聯合多個信號途徑對WUS進行表達調控^[11]。WUS啟動子中的一個57 bp區域（位于轉錄起始位點上游550 bp）能夠維持WUS在組織中心的正常時空表達模式。這個區域中有2個相鄰的短序列在WUS的轉錄調控過程中發揮作用。眾多調節信號相互作用后和這2個序列相互結合從而調控WUS的轉錄。

2.1 WUS的直接調控因子

迄今為止發現的能夠與WUS啟動子直接作用的基因是染色體重塑因子BRCA1-ASSOCIATED RING DOMAIN1（BARD1）和SPLAYED（SYD）。WUS表達的激活受到SPLAYED（SYD）染色質重塑因子的直接調控，SYD編碼一種ATP酶，可促進DNA模板形成轉錄結構而啟動轉錄^[12-13]。BARD1編碼的蛋白具有磷酸化依賴性，在SAM結構的維持方面發揮功能。BARD1突變使WUS只在組織中心邊緣表達，破壞SAM結構。BARD1蛋白不僅與WUS啟動子存在直接作用，還與SYD之間有互作關系，說明BARD1通過抑制染色質重塑過程影響WUS表達^[14]。

2.2 WUS的間接調控因子

WOX9是WUS表達的正調控基因，其突變體表型為SAM功能喪失，WUS和CLV3表達量降低。遺傳分析結果表明WOX9在促進WUS表達的同時也受到CLV3的負調控，三者可以形成輔助性的負反饋調節途徑^[5]。

APETALA2（AP2）是花發育ABC模型中的A功能基因，現有研究結果說明AP2可能在WUS上游起正調控作用。AP2突變表型也是SAM活動過早停止^[17]。OBERON1（OBE1）和OBERON2（OBE2）是AP2的功能冗余基因^[11]，這2個基因的雙突變體表現出SAM活動停止，WUS和CLV3表達水平降低。說明這2個基因具有維持干細胞特性的功能。

MERISTEM DEFECTIVE（MDF）編碼的蛋白可能在轉錄調控和RNA加工過程中對WUS表達發揮正調控作用。研究證明mdf突變體表型為SAM活動停止，WUS表達量降低；MDF過表達會導致異位分生組織形成^[18]。

ULTRAPETALA1（ULT1）和HANABA TARANU（HAN）是WUS的負轉錄調控因子。ULT1在生長發育后期對WUS表達起到負調控作用。ULT1在發育中的花器官和胚分生組織中表達，ult1表型為花序和花分生組織膨大，說明ULT1在花形成過程中對WUS表達調控起重要作用。HAN是GATA-3類轉錄因子，可控制表達WUS基因細胞的數目，使分生組織中心區和器官原基之間形成分界線^[19]。

質譜結果顯示出成熟的CLV3編碼產物含有1個分泌型糖肽（13個氨基酸）和2個羥脯氨酸殘基^[22-23]，在翻譯后加工過程中1個羥脯氨酸殘基發生了糖基化反應，對其生理功能和生物活性起決定作用，未發生糖基化反應的CLV3編碼產物生物學活性和受體結合活性都非常低^[22-23]。CLV3在L1至L3層的干細胞中表達，其翻譯產物在細胞中以信號分子的形式向下擴散，可以被CLV1受體激酶和CLV2/CRN受體激酶復合物傳遞而發揮功能^[24]。

CLV3作為信號分子通過CLV1、CLV2、CORYNE（CRN）共同組成通路向下傳遞，對WUS的表達發揮抑制作用^[24]。受體激酶CLV1的亮氨酸富集結構域可以結合CLV3；無激酶活性的受體CLV2必須與激酶CORYNE（CRN）結合后才能形成功能復合體結合CLV3。CLV1、CLV2、CRN具有跨膜結構域，可以固定到質膜上，其中CLV1可以自身形成二聚體，CLV2/CRN形成四聚體，CLV1、CLV2也可以在CRN的介導下形成CLV1/CRN/CLV2六聚體[25，26]。CLV1、CLV2、CRN組成的大量信號通路保證了CLV3信號的傳遞效率。

CLVATA3（CLV3）基因在SAM干細胞區特異表達，與WUS的表達在L3層中重合。clv3表型為WUS表達區域的擴大，SAM膨大。CLV3過表達使SAM活動過早停止^[9]，與wus表型類似。這說明組織中心標記基因WUS能夠促進CLV3表達，而CLV3可以抑制WUS表達。二者形成1個負反饋調節環，成為SAM中干細胞區基因調控網絡的中心環節。WUS表達形成的信號因子轉運至干細胞并在干細胞中梯度分布而維持干細胞活性，內周邊區的細胞能接受這種信號因子發生脫分化回到干細胞狀態，從而維持干細胞數量的穩定。

4 WUS和CLV3在不同植物SAM中的功能保守性

除擬南芥外，WUS和CLV3基因也在其他植物SAM干細胞調控中發揮作用。許多雙子葉植物中已經發現了WUS的同源基因，這些基因在功能上有保守性。其突變體與擬南芥wus突變體表型類似，即SAM活動的過早停止^[27-30]。已經發現的雙子葉植物WUS同源基因都在SAM的組織中心表達。

單子葉植物水稻、玉米和短柄草中也發現了WUS的同源基因，但這些基因在功能上具有多樣性。玉米ZmWUS1/2和水稻OsWUS營養生長時期表達區域主要集中于分生組織周邊區域和葉原基，SAM中只有短暫表達；生殖生長時期這3個基因與擬南芥CLV1同源基因在SAM中同步表達^[25]。ZmWUS1/2和OsWUS表達模式說明了單子葉植物莖構造和葉片發育過程的特殊性，暗示著單子葉植物中可能存在不同于WUS/CLV3的干細胞調控途徑。被子植物和裸子植物的WUS/WOX基因家族分析說明WUS的原始功能可與側生器官原基發生相關。雖然擬南芥WUS功能模式在其他植物中通用性不強，但是該基因的功能可能具有一定的保守性^[25]。

CLE基因家族是植物中最廣泛存在的基因家族^[23]，水稻、玉米、大豆、楊樹、苜蓿等甚至苔蘚和藻類中都發現了CLE基因^[31-32]。水稻FLORAL ORGAN NUMBER1（FON1）是CLV1同源基因，其突變體表型為分生組織的擴大和花器官數量的增多。FON2和FCP1（FON2-LIKE CLE PROTEIN1）是CLV3的同源基因，其中FON2和FON1共同發揮維持SAM和花序分生組織的功能，FCP1在SAM和RAM中發揮維持分生組織細胞分裂的功能。水稻FON2和FCP1在功能上已產生分化，分別調控不同的分生組織行為。玉米的CLV1和CLV2同源基因是THICK TASSEL DWARF1（TD1）和FASCIATED EAR2（FEA2）。玉米中這2個基因的缺失對分生組織維持和花器官數量都沒有影響，表達分析顯示TD1沒有在分生組織中表達^[26]。這說明CLE基因在單子葉植物分生組織中也發揮作用，但信號機制和功能已經發生變化。這種功能變化在雙子葉植物中也同樣存在：苜蓿SUPERNUMERIC NODULES（SUNN）和百脈根HYPERNOD-ULATION ABERRANT ROOT 1（HAR1）是CLV1的同源基因，其功能不是維持分生組織而是促進根瘤形成。這2個基因的突變體表型都是根瘤數量增加，分生組織沒有變化^[32]。

5 KNOX基因家族和植物激素對SAM活動的調控作用

SHOOT MERISTEMLESS（STM）是獨立于WUS/CLV3途徑在SAM干細胞維持中發揮重要功能的轉錄因子，編碼Class I KNOX（knotted1-like homeobox）家族的蛋白^[33]。STM在分生組織的各個部位表達，發揮抑制細胞分化的作用^[34]。SAM中STM和WUS的作用互補：STM阻止細胞分化，WUS使一部分細胞特化為干細胞。STM和WUS的共同作用保持著SAM中干細胞增殖和器官原基形成的平衡，是維持SAM正常活動的重要保證^[35]。

植物生長調節物質中的生長素和分裂素在植物莖尖、根尖中作用相反。細胞分裂素在促進莖尖中細胞分裂的同時也促進根尖中細胞的分化；生長素促進根尖中細胞分裂和莖尖中細胞分化。SAM中周圍區域高水平的生長素和赤霉素（GA）與側生器官原基的生長點緊密相連。高水平的細胞分裂素（CK）主要集中在SAM的中央區域中，促進干細胞分裂和維持脫分化狀態^[36]。SAM中STM所屬的KNOX轉錄因子家族基因發揮促進細胞分裂素積累和抑制赤霉素積累的作用。這2種植物激素積累分別可以促進細胞分裂和阻止細胞分化。KNOX通過抑制GA20氧化酶活性和刺激GA2氧化酶活性這2個單獨的過程阻止赤霉素在SAM的中心區域積累。KNOX基因能夠促進葉原基基部GA2氧化酶的表達使赤霉素失活，將激活型赤霉素限制在葉原基中，因此KNOX基因通過阻止赤霉素在SAM中心區域積累而抑制干細胞分化^[37]。

細胞分裂素信號可以促進A型反應調節因子ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS（ARRs）基因的轉錄，二者之間形成一個負反饋調節系統。WUS直接抑制細胞分裂素應答調控因子ARR7在SAM中的表達，以一種非常精確的方式控制細胞分裂。玉米A型反應調節因子ABPHYL1基因在葉原基基部表達，對葉片發育過程中的細胞分裂素應答起到緩沖作用。水稻LONELY GUY（LOG）基因編碼產物可將失活性細胞分裂素轉變為激活型細胞分裂素^[38]，該基因在SAM頂端干細胞部位特異性表達。擬南芥中已經克隆出LOG同源基因，已經證明該基因和LOG具有相似的表達模式^[6]。

SAM的周圍區域（PZ）中，干細胞和器官發生處于一種平衡狀態。KNOX和促進葉器官形成的轉錄因子ASYMMETRIC LEAVES相互作用維持著這種平衡狀態。ASYMMETRIC LEAVES1（AS1）屬于MYB家族的轉錄因子，AS2是植物特有的LATERAL ORGAN BOUNDARY DOMAIN（LBD）基因家族成員。AS1/2在葉原基形成過程中表達，對BP、KNAT2和KNAT6表達起到抑制作用。除擬南芥外，在玉米和金魚草中也發現了相似的基因互作模式^[39]。葉原基中的表觀遺傳調控由GENERAL TRANSCRIPTION FACTOR GROUP E6（GTE6）實現，該蛋白直接調控AS1表達。組蛋白H3/H4的蛋白伴侶可以和AS1/2蛋白結合形成染色體重塑復合物抑制側生器官原基中KNOX基因的表達。as1/2突變體中KNOX基因的異位表達可以在葉片中形成分生組織[34，37]，因此KNOX的準確表達是影響葉正常發育的重要因素。

6 展望

SAM的調控信號網絡十分復雜，其中包含許多調控因子和相互交叉的調控途徑。如果將已有的互作網絡繪制成一個調控模型，可以看出WUS位于該模型的中心，是SAM中干細胞調控的主要調控因子。同樣，KNOX調控途徑可以認為是控制分化的中心調控途徑。WUS/CLV3和STM/KNOX途徑在維持SAM正常功能方面共同起決定性作用。而STM/KNOX途徑和WUS/CLV3途徑又通過植物激素相互作用，保證SAM頂端處于一個高細胞分裂素低赤霉素的環境。與WUS/CLV3同時存在的其他反饋調節途徑也在SAM中發揮重要作用，它們通過負反饋調節功能共同維持干細胞內環境穩定。

可以從2個角度去理解為何植物SAM調控需要大量的調控因子參與。一是必須有大量的功能冗余因子存在，保證某個因子功能喪失時同樣可以維持SAM正常活動；二是持續形成干細胞保證形態建成的過程需要許多信號系統進行輔助調節以維持分裂分化平衡。對參與SAM調控的因子進行詳細的時空動態表達分析，可以對干細胞增殖和分化行為進行詳細說明，同時可以對已知途徑進行修正，而不同途徑的相互聯系則需要更多的證據進行補充。

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